MMP-2和TIMP-2在POAG患者小梁細胞中的表達及其作用機制研究

徐為海 莊穎

(江蘇省濱?？h人民醫(yī)院，江蘇 鹽城 224500)

青光眼是一種復雜的視神經(jīng)病變，其中大多數(shù)為原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)。小梁網(wǎng)(trabecular meshwork，TM)是位于虹膜角膜角的復雜組織，由細胞外基質(zhì)(ECM)和嵌入在其中的小梁細胞組成[1-2]。ECM的組成受不斷地特異性的降解和合成的動態(tài)調(diào)節(jié)。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類降解膠原和蛋白聚糖的酶，TIMPs通過與MMPs結(jié)合來抑制MMPs的活性，小梁細胞也能產(chǎn)生TIMPs和MMPs，這兩種蛋白質(zhì)起著調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)降解的協(xié)同作用[3-4]。本研究主要研究MMP-2及其在開角型青光眼患者小梁細胞中的表達情況，并初步分析其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 本研究中使用的青光眼小梁網(wǎng)細胞(POAG- HTM)均來源于小梁切除術(shù)中的POAG患者，收集病人的小梁組織；正常人的小梁組織細胞(HTM)來源于健康人意外眼球損傷所導致的嚴重眼球破裂無法縫合修補需行眼球摘除的患者，并對該患者相關(guān)的病史，對側(cè)眼行詳細眼科檢查，已排除青光眼。本研究中所有患者和健康對照組均提供書面知情同意書并經(jīng)倫理審查委員會批準。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 原代小梁網(wǎng)細胞的培養(yǎng)：將收集到的小梁網(wǎng)組織，浸潤于DMEM/F12培養(yǎng)基中，將組織剪成乳糜狀，接種于培養(yǎng)瓶壁，放置在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。詳細的培養(yǎng)方法參照文獻[5-6]。

1.2.2MTT法檢測小梁細胞的增殖 青光眼患者的小梁細胞(POAG-HTM)和正常人的小梁細胞(HTM)均取第3次傳代的細胞，用于實驗研究。觀察兩種細胞在培養(yǎng)過程中，分別在12 ，24 ，48，72 h時的增殖情況。采用MTT法檢測，具體的檢測步驟參照文獻[7].

1.2.3細胞形態(tài)觀察NSE、FN、LM染色 采用兔抗人纖維連接蛋白(FN)單克隆抗體、小鼠抗人層粘連蛋白(LM)單克隆抗體、小鼠抗人神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)單克隆抗體(福州新步公司)對細胞進行染色，觀察細胞形態(tài)。使用尼康Eclipse TE2000-U倒置熒光顯微鏡(Nikon，Tokyo，Japan)觀察FN、LM、NSE的染色；具體的操作步驟參照文獻[8]。

1.2.4RT-PCR檢測相關(guān)基因的mRNA表達 收集48小時的兩組細胞，采用QIAGEN總RNA提取試劑盒提取各組小梁組織細胞總RNA，具體的操作步驟參照說明書，重復3次。各組總RNA 2 μg，按RT-PCR試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR。其它的反應條件參照文獻[8]。相關(guān)基因的引物見表1。

表1 基因的引物序列

2 結(jié) 果

2.1MTT法檢測POAG-HTM細胞與HTM細胞的增殖 將兩種細胞分別接種置96孔板，接種的濃度均為1x105mL左右，完成后，放置在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當培養(yǎng)置12，24，48，72 h時，檢測細胞的生長狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩組的細胞生長速度并無太大差別，隨著培養(yǎng)時間的增加，兩種細胞都明顯增殖；在72 h時，POAG-HTM細胞數(shù)比HTM細胞數(shù)有下降，但差異不明顯。見圖1。

圖1 POAG-HTM細胞與HTM細胞的增殖

2.2不同染色方法觀察兩種細胞的形態(tài) 于第三代細胞的培養(yǎng)過程中收集了48 h的兩種細胞，分別采用NSE染色、FN染色、LM染色等染色方法，觀察兩組的細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)小梁網(wǎng)細胞NSE染色都呈陽性，兩組的細胞形態(tài)沒有明顯差別，可見彌漫性紅色顆粒遍及整個細胞；其FN染色均呈陽性，胞質(zhì)呈紅色，顆粒狀；LM染色顯示：胞質(zhì)呈棕色，彼此相連呈單層網(wǎng)狀。結(jié)果顯示，患有青光眼患者的小梁細胞在結(jié)構(gòu)形態(tài)上并無明顯差別，不同的染色方式顯示的結(jié)相似，但在LM染色中稍有不同，在HTM細胞中其細胞質(zhì)彼此相連不明顯，而在POAG-HTM細胞中彼此的連接更明顯，而其細胞核看不清晰。見圖2。

注：圖a-b為HTM 細胞和POAG-HTM 細胞的NSE染色；圖c-d為HTM 細胞和POAG-HTM 細胞的FN染色；圖e-f為HTM 細胞和POAG-HTM 細胞的LM染色。

圖2兩組細胞培養(yǎng)48 h的細胞形態(tài)觀察

2.3MMP-2在POAG-HTM細胞中表達 分別收集48 h的兩組細胞，分別提取total RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR檢測。見圖3。

注：培養(yǎng)48 h的兩組細胞中MMP-2 mRNA的表達。圖a為MMP2的電泳條帶圖，圖b是對圖a中條帶亮度的計算統(tǒng)計，為相對表達量。*：P<0.05

圖3MMP-2在POAG-HTM細胞中表達

2.4TIMP-2 在POAG-HTM細胞中表達 分別收集48 h的兩組細胞，分別提取total RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR檢測。見圖4。

注：培養(yǎng)48 h的兩組細胞中TIMP-2 mRNA的表達。圖a為TIMP-2的電泳條帶圖，圖b是對圖a中條帶亮度的計算統(tǒng)計，為相對表達量。**：P<0.05。

圖4TIMP-2 在POAG-HTM細胞中表達

2.5影響MMP與TIMP家族基因變化的可能信號通路 結(jié)果顯示， MMP與TIMP家族的基因?qū)S持細胞外基質(zhì)穩(wěn)定具有重要作用。TGF-β1與bmp7的表達是否發(fā)生變化的實驗結(jié)果顯示：POAG-HTM細胞中TGF-β1的條帶亮度高于HTM細胞，而bmp7的條帶亮度均低于HTM細胞見圖5。

注：圖a為PCR電泳圖；圖b-c分別為TGF-β1與bmp7基因表達的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。*：P<0.05;**：P<0.05。

圖5POAG-HTM細胞與HTM細胞中，TGF-β1與bmp7基因mRNA的表達

3 討 論

POAG是最常見的一種視神經(jīng)退行性病變，表現(xiàn)為RGCs及其視神經(jīng)軸突在視神經(jīng)中的緩慢進行性變性，導致視神經(jīng)頭的結(jié)構(gòu)改變及相應的視野缺損[9]。小梁網(wǎng)對房水的阻力是原發(fā)性開角型青光眼發(fā)生發(fā)展的主要原因。原發(fā)性開角型青光眼眼小梁網(wǎng)中膠原、前聚糖等細胞外基質(zhì)成分積累，其產(chǎn)生與降解的異常平衡被認為是潛在的致病因素之一。TIMP是基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑，表達于組織中常見的一種糖蛋白。MMPs是一類降解細胞外基質(zhì)的一類多肽家族，TIMPs家族抑制MMPs家族基因的功能，抑制MMPs發(fā)揮正常的功能，兩者共同維護細胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)[10]。

本研究在細胞的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，HTM細胞與POAG-HTM細胞的生長過程并無差別，而在細胞形態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)，LM染色的結(jié)果稍有差異，在HTM細胞中其細胞質(zhì)彼此相連不明顯。與正常的HTM細胞相比，開角型青光眼患者的小梁細胞中TIMP-2的表達增加，MMP2的表達降低。有研究表明，TIMPs抑制MMPs的活性，與本研究的結(jié)果一致。有研究[12]表明，POAG最常見的危險因素是眼壓升高，MMPs灌注時，眼內(nèi)流出量增加，而組織抑制劑TIMP-2對MMP活性的抑制導致流出量減少。結(jié)合本研究的實驗結(jié)果，可以說明原發(fā)性開角型青光眼小梁網(wǎng)上MMP-2表達很弱，MMP-2的表達進一步下降，說明正常人小梁依賴MMP-2的高表達降解小梁網(wǎng)ECM，維持小梁網(wǎng)篩網(wǎng)狀高通透性，房水流出通暢，眼壓得以維持正常；在原發(fā)性開角型青光眼中由于MMP-2表達下降，其降解小梁網(wǎng)ECM的功能下降，導致ECM在小梁網(wǎng)處異常的、過多的堆積，小梁網(wǎng)通透性下降，房水流出阻力增加，眼壓升高；隨著青光眼病程進展，MMP-2表達逐步明顯降低，小梁網(wǎng)ECM堆積進一步增加，小梁網(wǎng)通透性進一步下降，眼壓持續(xù)升高，終致病程發(fā)展至晚期青光眼。有研究[13]表明，TGF-β在ECM重建過程中起著重要的作用，而本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)TGF-β1和 bmp7表達也是增加的，說明在原發(fā)性開角型青光眼小梁網(wǎng)細胞中TGF-β1的增加，促進了TIMP-2的表達，從而抑制了MMP2的表達，而且TIMP家族相關(guān)基因的表達都增加，MMP家族的相關(guān)基因的表達都降低了。由此可知，TGF-β的信號通路在維持小梁網(wǎng)ECM的通透性有這重要的作用。

本文圖2～5見封三。