MiR-19a在骨肉瘤預后中的臨床意義*

羅小端，鐘繼濤，宋 澤，聶華明，王泉雄

(云夢縣中醫(yī)院，湖北 云夢 432500)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)占兒童惡性腫瘤的6%，年發(fā)病率約為3/100萬[1]，有惡性程度高、較早發(fā)生侵襲和血性轉移、預后差等特點[2]。骨肉瘤的發(fā)生與遺傳、環(huán)境等多種因素有關，近年來研究表明[3]，非編碼小分子miRNA 在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用。miRNA調控約1/3的蛋白編碼基因，并且參與了包括細胞增殖、分化、細胞周期和凋亡等在內的諸多生理生化過程。MiR-19a作為一種新型腫瘤標志物具有非常重要意義，其生物學特征有助于骨肉瘤的診斷和預后，也為藥物的靶向研究提供理論依據(jù)和新的治療前景。因此，我們主要研究miR-19a在骨肉瘤中的表達情況，探討其在骨肉瘤患者診斷及預后中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取武漢大學中南醫(yī)院2012～2017年骨科收治的骨肉瘤患者病理切片中90例凍存骨肉瘤組織及其對應的癌旁非腫瘤組織標本，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。其中男45例，女45例；年齡7～65歲，年齡<22歲患者47例，年齡≥22歲患者43例。隨訪1～36個月，其中隨訪期間總死亡17例。Enneking外科診斷分期[4]:Ⅰ期及Ⅱa期病例53例，Ⅱb期及Ⅲ期病例37例。

1.2 方法

將組織標本使用TRIzol及氯仿提取RNA。取1μg總RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，用Real-Time PCR內參基因GAPDH引物做Q-PCR擴增，檢測基因miR-19a的表達水平。Real-Time PCR反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)25μL，PCR Forward Primer(10μM)2μL，PCR Reverse Primer(10μM)2μL，ROX Reference Dye(50×)1μL，DNA模板4μL，ddH20(滅菌蒸餾水)16μL；反應條件：95°C、30s一個循環(huán)，然后95°C、5s，60°C、30s進行四十個循環(huán)。

每一個基因的表達水平以其相對內參GAPDH的水平形式呈現(xiàn)。使用的PCR引物如下:MiR-19a上游，5'-GCGTGTGCAAATCTATGCAA-3';下游，5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';U6上游，5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。用GraphPad Prism 6軟件進行定量和分析，最后結果以2-△△Ct分析。

1.3 觀察指標

(1)比較骨肉瘤患者骨肉瘤組織樣本及癌旁非腫瘤組織中miR-92a表達水平。

(2)miR-19a對骨肉瘤患者預后的影響：將90例骨肉瘤患者以miR-19a表達的中位值為分界線，分為高表達組(n=45)和低表達組(n=45)，其表達與患者性別、年齡、腫瘤部位沒有統(tǒng)計學意義，兩組患者具有可比性。所有患者均獲得隨訪，隨訪時間1～36個月，末次隨訪時間為2017年12月。

(3)骨肉癌組織中miR-19a表達與臨床分期及臨床指標：miR-19a表達與腫瘤的TNM分期、腫瘤的體積、有無遠處轉移之間的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)均應用統(tǒng)計學軟件SPSS 22進行分析，計量資料采用非配對t檢驗，計數(shù)資料行卡方檢驗。當P<0.05時，表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miR-19a在骨肉瘤組織樣本及癌旁非腫瘤組織中的表達情況

miR-19a在骨肉瘤組織中的表達量為(2.439±0.162)，在瘤旁組織中的表達量為(1.547±0.144)，骨肉瘤組織中的表達水平明顯高于對應癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖1。

圖1 Q-PCR檢測miR-19a在骨肉瘤組織及其癌旁組織中的表達比較，***P<0.001(n=90)

2.2 miR-19a對骨肉瘤患者預后的影響

隨訪結果，因復發(fā)轉移死亡患者總共有16例(MiR-19a低表達組5例，高表達組11例)，MiR-19a高表達組患者3年生存率明顯低于低表達組(P<0.05)，見圖2(封三)。

2.3 骨肉癌組織中miR-19a表達與臨床分期及臨床指標的關系

在骨肉瘤患者中，miR-19a的低表達和高表達比較，腫瘤體積、遠處轉移和TNM分級有差異(P=0.001)，見表1。

表1 骨肉瘤組織miR-19a水平與患者臨床病理參數(shù)之間的相關性

3 討 論

骨肉瘤多起源于長骨干骺端，隨著診療水平的提高，手術及新輔助化療等綜合治療的應用，5年生存率提高至60%～70%[5]。骨肉瘤早期癥狀缺乏特異性，大多數(shù)患者到晚期才被確診。因此，尋找高靈敏度、高特異度的生物標志物在骨肉瘤的篩查和早期診斷中越來越重要[6]。研究表明[7]miRNA在骨肉瘤的篩查、診斷和預后判斷中具有重要意義，miR-17-92與人類癌癥的發(fā)病密切相關，在多種惡性腫瘤中表達上調，包括結腸癌、B細胞淋巴瘤、胃癌和小細胞肺癌。miR-17-92基因簇定位于13q31.3(即13號染色體25號開放閱讀框的3號內含子區(qū)域)，該基因編碼產(chǎn)生6個成熟的miRNA：miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b和miR-92a[8]。

miR-19a作為miR-17-92基因簇基因的重要成員[9]，促進其表達可提高抑癌基因(PTEN)的活性及有效含量，提高PTEN基因啟動子的表達水平，形成一個開放的染色質結構，促進與轉錄因子Egr-1的結合，進而誘導基因的表達[10-11]；同時可增強PTEN蛋白與目標蛋白PDZ結合序列的相互作用，抑制PTEN/PI3K/Akt信號轉導通路，阻止腫瘤生長[12-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a在癌組織的表達明顯高于其對應的癌旁組織(P<0.05)；且高表達與腫瘤的病理分期密切相關；遠處轉移率也明顯高于低表達組(P<0.05)；預后分析表明miR-19a的表達情況與骨肉瘤患者預后密切相關。說明miR-19a通過參與細胞信號通路的調節(jié)而影響腫瘤增殖與遷移的生物學特性，具有作為骨肉瘤生物標志物的潛力。

綜上所述，作為骨肉瘤預后生物標志物，miR-19a具有重要的應用前景和臨床應用價值。