食品檢測用4 種病原菌基因組試劑盒提取方法的比較與優(yōu)化

楊金玉 楊煥蝶，2 陳相艷 王易芬 朱麗萍 陳蕾蕾，2*

（1 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所 山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點實驗室 濟南 250100 2 山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 濟南 250014 3 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點實驗室 濟南 250353）

食源性病原菌是可以引起食物中毒或以食品為傳播媒介的致病性細(xì)菌，威脅著人類的健康，能引起嚴(yán)重的食品安全問題。食品致病菌種類較多，常見的有致瀉大腸埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella spp.）和單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）等。建立準(zhǔn)確、靈敏、快速、特異性的檢測方法用于食品致病菌的檢測，對預(yù)防和控制食品微生物食物中毒事件的發(fā)生起重要作用。

致瀉大腸埃希氏菌是全球細(xì)菌性食物中毒的主要致病菌，出血性大腸埃希氏菌O157：H7 是常見的致瀉大腸埃希氏菌中的一種，能引起人類出血性結(jié)腸炎或血性腹瀉，并可進一步發(fā)展為溶血性尿毒綜合征，其造成的死亡率達(dá)10%～30%[1-2]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，簡稱單增李斯特氏菌，是一種人畜共患病的病原菌，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。食品中存在的單增李斯特氏菌對人類的安全具有威脅，該菌在4 ℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。臨床癥狀為孕婦感染和新生兒膿血癥等[3-4]。金黃色葡萄球菌也是引起食物中毒的重要病原菌，其毒力與腸毒素密切相關(guān)[5-6]。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生難題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%[7]。沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌。蛋、鮮乳、家禽和肉類產(chǎn)品是沙門氏菌的主要傳播媒介，據(jù)統(tǒng)計，在世界各國的細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首[8-9]。

當(dāng)下微生物污染引起的疾病暴發(fā)模式也從局部范圍集中式小暴發(fā)向全社會范圍以散點病例組成的大暴發(fā)轉(zhuǎn)變。為有效識別大暴發(fā)，快速、準(zhǔn)確的食品病原菌檢測方法迫在眉睫。傳統(tǒng)培養(yǎng)法耗時長，已不能滿足目前食源性病原菌的檢測。目前發(fā)展形成了多種快速檢測方法，這些方法主要是基于分子生物學(xué)的聚合酶鏈反應(yīng)PCR 法[10]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法[11-12]和基于免疫學(xué)的快速檢測方法-酶聯(lián)免疫吸附法[13]等。目前基于分子生物學(xué)最常用的有普通PCR 法、熒光定量PCR 法和近年來興起的數(shù)字PCR 法等。這些檢測方法的共同點是需要DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為反應(yīng)的模板，模板可以為病原菌的基因組DNA 或者是攜帶特征毒力基因的質(zhì)粒DNA。DNA 屬于生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不同于其它標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具有生物活性等特點。目前，食品微生物類參考物質(zhì)在全球范圍內(nèi)整體較為匱乏，同時由于生物安全問題，所以這些參考物質(zhì)在國際共享過程中出現(xiàn)許多困難。建立食源性微生物檢測即用型基因組核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將解決我國食品微生物檢測核酸參考物質(zhì)缺失這一關(guān)鍵問題，實現(xiàn)自主知識產(chǎn)權(quán)核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在食品微生物檢測的廣泛深入應(yīng)用，擺脫食品微生物檢驗對國外標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的依賴。

本研究以4 種常見的食源性病原菌作為研究對象，結(jié)合國產(chǎn)天根細(xì)菌基因組提取試劑盒，針對不同的菌株，優(yōu)化相應(yīng)細(xì)菌基因組的提取方法，使4 種食源性病原菌的基因組樣品均符合核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量要求，為后期大量制備具有自主知識產(chǎn)權(quán)的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)奠定基礎(chǔ)，對我國食品檢測具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

實驗菌株和特征毒力基因引物如表1 所示。大腸桿菌O157：H7 的特征毒力基因引物參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.6-2016[14]及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1869-2007[15]；腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌毒力基因引物參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1869-2007[15]。

表1 菌株和引物序列Table 1 The strains and primers applied

培養(yǎng)基，北京陸橋BHI 肉湯培養(yǎng)基；瓊脂糖，北京全式金公司；RNase A，天根RT405-12。

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒：OMEGA 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（D3350-01）；天根細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（DP302）。

PCR 反應(yīng)試劑：2×Taq PCR 預(yù)混試劑Ⅱ（KT211），天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IFD 型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫?fù)u床，上海智誠分析儀器制造有限公司；水浴鍋，北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司；冷凍離心機，Eppendorf，5415R；電泳儀Thermal Cycler，C1000 Touch，美國伯樂；水平電泳儀、JY04S-3C 凝膠成像系統(tǒng)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng) 取出甘油管保存的菌株，快速解凍，以1%的接種量接種到已滅菌的BHI 肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)12 h。

1.3.2 試劑盒法提取細(xì)菌基因組DNA

1.3.2.1 采用OMEGA 細(xì)菌基因組提取試劑盒（D3350-01）提取細(xì)菌基因組 細(xì)菌基因組提取步驟參考試劑盒說明書，基因組DNA 樣品保存于-20 ℃。

1.3.2.2 采用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒（DP302）提取細(xì)菌基因組 細(xì)菌基因組提取步驟參考產(chǎn)品說明書，DNA 樣品保存于-20 ℃。

1.3.3 基因組DNA 濃度及純度測定 取1 μL 基因組DNA 樣品，使用Thermo Nanodrop 2000/2000c 測量基因組DNA 的純度及濃度。

1.3.4 基因組DNA 完整性和純度的檢測 取5 μL 基因組DNA 樣品，點樣于1%的瓊脂凝膠中，175 V 恒壓電泳25 min，緩沖體系采用1×TBE 緩沖液，電泳結(jié)束后，使用溴化乙錠（EB）替代品GoldView 顯色，于凝膠成像儀中紫外檢測觀察DNA 樣品的完整度和純度。

1.3.5 病原菌特征毒力基因擴增反應(yīng)及檢測 根據(jù)國標(biāo)GB 4789.6-2016 和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1869-2007 提供的病原菌的特征毒力基因的引物序列（表1）合成引物（生工生物工程（上海）股份有限公司），分別以4 種病原菌基因組為模板，克隆相應(yīng)的特征毒力基因，PCR 擴增反應(yīng)體系如表2 所示，PCR 擴增反應(yīng)程序如表3 所示。

表2 PCR 反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system

表3 PCR 反應(yīng)程序Table 3 PCR reaction procedure

結(jié)果檢測：反應(yīng)結(jié)束后取5 μL 反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件同1.3.4。

防治柑桔鳳蝶：在柑橘鳳蝶的幼蟲發(fā)生較為嚴(yán)重的時候，選用10%吡蟲啉可濕性粉劑3000倍液對害蟲進行挑治，可以起到防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種細(xì)菌基因組試劑盒提取基因組效果比較

為比較進口試劑盒和國產(chǎn)試劑盒提取本研究使用的4 種病原菌基因組的效果，分別使用兩種不同的試劑盒提取基因組。分別取1 mL 過夜培養(yǎng)的菌液，按照試劑盒提供的方法提取基因組，結(jié)果如表4 所示。

在基因組純度上，使用OMEGA 試劑盒提取的基因組樣品A260/A280和A260/A230的值均在1.7～2.0 范圍內(nèi)，而天根試劑盒提取的基因組樣品A260/A230值除單增李斯特氏菌以外，均低于1.7，說明OMEGA 試劑盒提取的基因組純度優(yōu)于天根試劑盒提取的基因組樣品。

在基因組濃度上，使用OMEGA 試劑盒提取的單增李斯特氏菌和腸炎沙門氏菌的基因組濃度比天根試劑盒提取的基因組濃度約高了一半，然而，對于大腸埃希氏菌O157：H7 而言，天根試劑盒提取的基因組濃度高于OMEGA 試劑盒；至于革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌，兩種試劑盒提取的基因組樣品濃度相當(dāng)，然而，使用OMEGA 試劑盒提取的基因組樣品純度高，A260/A230的值在1.7～2.0 范圍內(nèi)，說明沒有有機試劑和鹽離子等的污染。

表4 試劑盒法提取4 種食源性病原菌基因組質(zhì)量濃度和純度的比較Table 4 Comparison of the mass concentration and purity of genomic DNAs of four foodborne pathogens by genomic DNAs extraction kit

在基因組完整性和純度上，瓊脂糖凝膠電泳分析的結(jié)果（圖1）表明，兩種試劑盒提取的基因組條帶均一，無RNA 和蛋白質(zhì)污染，性狀良好。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析天根試劑盒（a）和OMEGA 試劑盒（b）提取的4 種病原菌基因組DNA 的完整性和純度Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of four pathogens’genomic DNAs extracted by TIANGEN kit（a）or OMEGA kit（b）

在基因組提取步驟上，OMEGA 試劑盒提取基因組的標(biāo)準(zhǔn)流程是16 步，大約需要花費1.5 h，而天根試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程是11 步，只需要花費大約0.5 h，大大縮短了基因組的提取時間，可為大量制備基因組樣品節(jié)約時間成本。

綜合上述分析，只有單增李斯特氏菌可直接使用國產(chǎn)的天根細(xì)菌基因組提取試劑盒制備基因組樣品，制備其它3 個菌的高質(zhì)量核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，OMEGA 試劑盒是更好的選擇。為擺脫國外產(chǎn)品對我國食品檢測行業(yè)的限制，降低生產(chǎn)成本，根據(jù)目前存在的問題，可對國產(chǎn)試劑盒的提取方法進行優(yōu)化，以制備濃度高及純度高的核酸樣品。

2.2 優(yōu)化國產(chǎn)細(xì)菌基因組提取試劑盒法提取病原菌基因組

表5 優(yōu)化后天根試劑盒法提取大腸埃希氏菌O157：H7 基因組的純度和質(zhì)量濃度分析Table 5 Purity and mass concentration analysis of E.coli O157：H7 genomic DNA extracted by optimized TIANGEN kit

2.2.2 金黃色葡萄球菌基因組天根試劑盒法的優(yōu)化 從表4 可見革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌分別按照OMEGA 和天根的試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)提取方法提取的基因組濃度均不高，并且天根試劑盒提取的基因組A260/A230比值較低，為1.2。這可能是由于革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，難以破壁，導(dǎo)致提取的基因組濃度較低。因此擬通過延長溶菌酶的作用時間，提高金黃色葡萄球菌的破壁效果，達(dá)到提高基因組濃度的目的。為獲得溶菌酶對金黃色葡萄球菌的最佳破壁時間，本研究對金黃色葡萄球菌的溶菌酶作用時間做了時間梯度試驗，結(jié)果如表6 所示。破壁時間小于4 h，基因組質(zhì)量濃度和純度均不理想，而隨著破壁時間的延長，金黃色葡萄球菌基因組質(zhì)量濃度逐漸提高，當(dāng)破壁時間延長至12 h 時，質(zhì)量濃度可達(dá)74.5 ng/μL，比破壁1 h 時的質(zhì)量濃度提高了4 倍，A260/A280和A260/A230的值也隨著升高，在1.7～2.0 之間，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求，因此選擇溶解酶裂解菌體12 h 作為將來大量制備金黃色葡萄球菌基因組核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的處理時間。以上結(jié)果說明對于革蘭氏陽性菌，提取基因組的關(guān)鍵是有效破壁，細(xì)胞壁裂解是影響基因組質(zhì)量濃度和純度的關(guān)鍵。

表6 天根試劑盒法提取金黃色葡萄球菌基因組質(zhì)量濃度和純度分析Table 6 Analysis of genomic mass concentration and purity of S.aureus extracted by TIANGEN kit

為驗證以上結(jié)果，重新處理了一批菌體，溶菌酶處理12 h，使用天根試劑盒進行基因組的提取，如表7 所示，金黃色葡萄球菌的質(zhì)量濃度在66.1～113.3 ng/μL 之間，相較于表4 所示的結(jié)果，濃度和純度大幅提高，說明對于金黃色葡萄球菌而言，延長溶菌酶破壁時間是提高基因組質(zhì)量濃度和純度的有效改進手段。

2.2.3 沙門氏菌基因組天根試劑盒法的優(yōu)化 根據(jù)表4 的結(jié)果可知，使用OMEGA 試劑盒提取的沙門氏菌基因組質(zhì)量濃度和純度均高于使用天根試劑盒提取的基因組樣品。為了提高天根試劑盒提取的沙門氏菌基因組的質(zhì)量濃度和純度，采取與大腸埃希氏菌O157：H7 一樣的處理方法，將菌體進行了生理鹽水的洗滌，之后進行基因組的提取，而提取所得的基因組純度并不理想，這說明相同的方法并不適用于不同的菌株。針對這一情況，本研究采取增加每個柱子上樣量的方式進行基因組提取。將1 mL 菌體量增加至2.5 mL，按照試劑盒提供的方法對菌體進行處理后，上樣到試劑盒的洗脫柱中，提取得到的基因組質(zhì)量濃度和純度如表8 所示。與表4 所示的結(jié)果想比，增大了上樣量后提取得到的基因組，不僅質(zhì)量濃度大幅提高，純度也達(dá)到了要求。最高的質(zhì)量濃度達(dá)到了181.4 ng/μL，最低的也達(dá)到了98.7 ng/μL，比最初的64.7 ng/μL 至少提高了52.5%。增大上樣量這一改進方法，既提高了質(zhì)量濃度，也提高了純度，這說明A260/A230的值與質(zhì)量濃度息息相關(guān)，質(zhì)量濃度提高了，A260值相應(yīng)也會提高，那么表征純度的指標(biāo)A260/A230值也會隨之提高。

表7 溶菌酶裂解金黃色葡萄球菌12 h 后提取的基因組質(zhì)量濃度和純度分析Table 7 Analysis of genomic DNAs’mass concentration and purity of S.aureus by lysozyme treatment for 12 h

表8 改進后天根試劑盒法提取沙門氏菌基因組質(zhì)量濃度和純度分析Table 8 Analysis of the genomic DNAs’mass concentration and purity of S.enteritidis extracted by modified TIANGEN kit

2.3 優(yōu)化后的試劑盒法提取的4 種病原菌基因組的完整性和純度檢驗

為了檢測優(yōu)化后的天根試劑盒法提取的4 種病原菌基因組的完整性以及純度，將提取的各基因組樣品取樣5 uL 進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2 所示。基因組條帶單一，無彌散現(xiàn)象，說明基因組樣品完整性良好，且無RNA 和蛋白質(zhì)污染，說明樣品性狀良好，可用于制備核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳分析4 種病原菌基因組DNAFig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of genomic DNAs of four pathogens

2.4 4 種病原菌相應(yīng)毒力基因PCR 擴增檢測

為了驗證提取的基因組樣品是目的基因組，根據(jù)GB 4789.6-2016 的檢測標(biāo)準(zhǔn)，以大腸埃希氏菌O157：H7 基因組樣品為模板，擴增其特征毒力基因（圖3）。uidA 是大腸桿菌的特征基因，長度為1 487 bp；其它4 個出血性大腸桿菌特征毒力基因escV、eae、stx2、rfbE（根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1869-2007）均擴增得到相應(yīng)大小條帶，分別為：544，397，324，499 bp；未擴增得到stx1 基因片段，說明本研究使用的大腸埃希氏菌O157：H7 菌株基因組不含志賀毒素stx1 基因。以上結(jié)果說明通過天根試劑盒提取得到的基因組樣品符合國標(biāo)GB 4789.6-2016 的要求，可用于制備核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1869-2007 提供的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌的特征毒力基因的引物序列，如圖4a 所示，以天根細(xì)菌基因組提取試劑盒提取得到的沙門氏菌基因組為模板，擴增得到了毒力因子基因invA 的片段，片段大小與標(biāo)準(zhǔn)一致；以金黃色葡萄球菌基因組為模板，克隆得到了毒力因子femA 的DNA 片段，為132 bp（圖4b），與標(biāo)準(zhǔn)一致；以單增李斯特氏菌基因組樣品為模板，PCR 擴增其特征毒力基因prfA，如圖4c 所示，得到274 bp 片段，與標(biāo)準(zhǔn)一致。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測大腸埃希氏菌O157：H7 的特征毒力基因PCR 擴增產(chǎn)物Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of the characteristic virulence genes of E.coli O157：H7

圖4 瓊脂糖凝膠電泳檢測3 種食源性病原菌的特征毒力基因PCR 擴增產(chǎn)物Fig.4 Agarose gel electrophoresis analysis of the characteristic virulence genes of three foodborne pathogens

3 結(jié)論

本研究比較了進口的OMEGA 細(xì)菌基因組提取試劑盒和國產(chǎn)的天根細(xì)菌基因組提取試劑盒提取4 種食源性病原菌基因組的結(jié)果，結(jié)果顯示OMEGA 試劑盒提取的基因組純度優(yōu)于天根試劑盒提取的基因組。為制備自主知識產(chǎn)權(quán)的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，從菌株到基因組試劑盒，都應(yīng)選用具有我國知識產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品，因此本研究結(jié)合天根細(xì)菌基因組提取試劑盒，針對不同菌株，優(yōu)化了細(xì)菌基因組的提取方法，提高了試劑盒提取的3 個菌株基因組的質(zhì)量濃度和純度。其中經(jīng)過生理鹽水洗滌菌體3 遍后，再提取基因組，提高了大腸埃希氏菌O157：H7 的純度；通過增大2.5 倍的腸炎沙門氏菌的上樣量，提高了其基因組的質(zhì)量濃度和純度，其中質(zhì)量濃度至少提高了52.5%；對于革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌，通過延長溶菌酶的破壁時間至12 h，使用天根試劑盒提取的基因組質(zhì)量濃度提高了約4 倍，A260/A280和A260/A230的值也提高至1.7～2.0 之間，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求。而單增李斯特氏菌使用天根試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)方法即可使提取的基因組質(zhì)量濃度和純度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求。經(jīng)過方法優(yōu)化，4 種食源性病原菌的基因組樣品均符合核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量要求，并且4 種病原菌的特征毒力基因檢測均為陽性，說明提取得到的基因組為目的基因組，這為后期大量制備具有自主知識產(chǎn)權(quán)的食源性病原菌核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，對我國食品微生物的快速檢測技術(shù)的發(fā)展和預(yù)防食品安全問題的爆發(fā)具有非常重要的意義。