1-脫氧野尻霉素對高脂飲食肥胖小鼠脂代謝的改善作用

楊忠敏 曾藝濤 丁曉雯 黃先智

（1 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室 重慶 400716 2 西南大學(xué)科技處 重慶 400716）

肥胖是熱量攝入與消耗不平衡而導(dǎo)致的一種健康問題，其主要特征是體內(nèi)過多脂肪堆積，從而誘導(dǎo)脂代謝異常[1]。近年來，肥胖在全球流行疾病中的比例顯著上升[2]。Karami 等[3]統(tǒng)計分析表明，飲食與肥胖存在極顯著性相關(guān)（P＜0.001）。已有研究證明，肥胖是一些非傳染性疾病的危險因素，如2型糖尿病、腫瘤、非酒精性脂肪肝以及高血壓等[4]。世界衛(wèi)生組織已將肥胖列入2013-2020 年非傳染性疾病預(yù)防和控制的全球計劃中[5]。肥胖的預(yù)防控制已成為食品和分子營養(yǎng)學(xué)研究的核心問題。

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一種哌啶類多羥基生物堿[6]，主要來源于植物，如桑葉、動物、微生物及人工合成。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究表明，DNJ 具有降糖、抗病毒等作用[7]。Tsuduki 等[8]2009 年通過給高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠灌胃DNJ（1.06 mg/kg bw/d）12 周，結(jié)果表明，DNJ 通過激活β 氧化系統(tǒng)抑制肝臟脂質(zhì)積累，不會導(dǎo)致肝功能障礙，首次提出DNJ 具有抗肥胖效應(yīng)。2013 年Tsuduki 等[9]繼續(xù)深入研究，通過給雄性小鼠灌胃DNJ（5 mg/kg bw/d）12 周，研究DNJ對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠脂代謝紊亂的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNJ 促使血漿增強脂聯(lián)素，降低甘油三脂（Triglyceride，TG），抑制肝臟中脂質(zhì)的積累，進(jìn)而防止飲食引起肥胖。Wang 等[10]通過體外實驗研究表明，桑葉中DNJ 通過ERK/PPARγ 信號通路抑制豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂肪生成。Do 等[11]通過從枯草芽孢桿菌分離DNJ，給高脂飲食誘導(dǎo)的雄性肥胖小鼠灌胃DNJ（10 mg/kg bw/d）12 周，結(jié)果表明，DNJ 能改善肝脂代謝異常，控制體重。目前雖有一些DNJ 對脂代謝影響的研究，但對具體的信號抑制途徑和影響脂代謝的框架結(jié)構(gòu)尚未建立。

本研究通過給小鼠飼喂高脂飲食，建立小鼠肥胖模型，并持續(xù)飼喂高脂飼料，模擬人類高脂飲食造成肥胖后并不積極控制飲食的模式，同時灌胃不同劑量的DNJ，探討DNJ 對這種飲食模式的小鼠脂代謝的影響及其機理，為DNJ 降脂功能產(chǎn)品的開發(fā)和機理研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物與飼料 100 只4 周齡昆明種清潔級小鼠（雌雄各半，體重（20±2）g），重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司（許可證號：SCXK（渝）2007-006）。

基礎(chǔ)飼料，重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司；高脂飼料，自制，配方：基礎(chǔ)飼料78%、白糖10%、豬油10%、膽固醇2%[12]。

1.1.2 主要試劑 DNJ（純度≥98%），北京德威鈉生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；脂聯(lián)素（Adiponectin，ADP）、內(nèi)脂素、游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）、脂肪合成酶（Fatty acid synthetasein，F(xiàn)AS）、?；o酶A 氧化酶（Acyl-CoA oxidase，ACO）、乙酰輔酶A 羧化酶（Acetyl Coa carboxylasec，ACC）、肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（Carnitine palmitoyl transferase-1，CPT-1）ELISA 試劑盒，廈門慧嘉生物科技有限公司；TG、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（High density liptein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒，四川邁克生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7020 型全自動生化分析儀，日本日立公司；zhengy H1 型酶標(biāo)儀，Gene Company Limited；F6/10 型勻漿機，上海弗魯克流體機械制造有限公司；H2500R-2 型冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNJ 的配制 分別稱取一定量的DNJ 標(biāo)品溶于0.9%的NaCl 溶液中，配制成質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.8 mg/mL 的DNJ 溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肥胖小鼠模型的建立 100 只4 周齡昆明種小鼠，用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，然后飼喂高脂飼料4 周，用于建立肥胖模型[13]。當(dāng)造模小鼠肥胖度＞20%，且與對照組小鼠存在顯著性差異時，認(rèn)為建模成功。剔除肥胖度不夠的小鼠。根據(jù)公式（1）計算肥胖度：

1.3.3 肥胖小鼠分組及飼養(yǎng)[14]隨機挑選80 只造模成功的肥胖小鼠（雌雄各半），隨機分為4 組，每組20 只（雌雄各半），即高脂對照組，DNJ 的低、中、高劑量組，根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果設(shè)置DNJ 灌胃劑量。各劑量組按5 g/d/只喂飼高脂飼料，自由飲水，1 周換2 次墊料，5 d 稱1 次體重。保持室溫（22±2）℃，12 h 輪換照明（7：00-19：00），通風(fēng)良好。肥胖模型小鼠分組及喂飼如表1 所示。

表1 肥胖模型小鼠分組及喂養(yǎng)Table 1 Grouping and feeding of obesity model mice

1.4 樣本采集及指標(biāo)測定

1.4.1 血液及組織樣本的獲取 小鼠灌胃40 d，禁食不禁水12 h，眼球取血后將小鼠脫頸椎處死，解剖，摘取肝臟和腹腔脂肪組織，按參考文獻(xiàn)[9]處理后稱重。

小鼠腹腔脂肪系數(shù)計算公式見參考文獻(xiàn)[15]。

1.4.2 指標(biāo)測定 按參考文獻(xiàn)[16]處理血樣，在全自動生化分析儀上測定血脂水平；用ELISA 試劑盒進(jìn)行血清FFA、內(nèi)脂素、ADP 的測定。

以1∶7 的質(zhì)量比向肝臟中加入PBS 緩沖液（pH 7.4）進(jìn)行勻漿，3 000 r/min 離心20 min，取上清液按照ELISA 試劑盒的方法測定肝臟中FAS、ACO、ACC、CPT-1 的活性。

肝臟脂肪含量的測定：將濾紙放入烘箱，100℃烘干至恒重，放入干燥器中冷卻后，稱取其質(zhì)量為m。準(zhǔn)確稱取已碾磨的肝臟樣品質(zhì)量m1，用已稱好的濾紙將樣品包裹好，防止肝臟樣品漏出。將紙包放入100 mL 帶蓋玻璃瓶中，加入20 mL 沸程60～90 ℃的石油醚，旋緊瓶蓋，在功率100%、超聲溫度55 ℃條件下超聲40 min，如此重復(fù)3 次，完畢后將紙包取出，105 ℃烘干至恒重，放入干燥器中冷卻后稱重m2[17]。根據(jù)公式（2）計算肝臟脂肪含量：

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DNJ 對高脂飲食肥胖小鼠體重的影響

由圖1 可知，在造模成功時（0 d），與正常對照組相比，其余4 組小鼠體重與其均存在極顯著差異（P＜0.05），造模組小鼠間體重均無顯著性差異（P＞0.05），表明高脂飲食會使小鼠肥胖。40 d 實驗結(jié)束時，模型對照組雌、雄小鼠體重較正常組分別增加19.43%、39.16%（P＜0.05），DNJ 高劑量組較模型組雌、雄小鼠體重分別減少13.08%、24.41%（P＜0.05）。

體重是衡量動物健康狀況的重要指標(biāo)之一，過輕或過重都不利于健康。高脂飲食會造成小鼠營養(yǎng)性肥胖，從而加劇肥胖小鼠的脂代謝紊亂[18]。本研究結(jié)果表明DNJ 能調(diào)節(jié)肥胖小鼠體重使之恢復(fù)至與正常小鼠無顯著性差異水平（P＞0.05）。

圖1 DNJ 對雌（a）、雄（b）小鼠體重的影響（n=10）Fig.1 Effect of DNJ on body weight of female（a）and male（b）mice（n=10）

2.2 DNJ 對高脂飲食肥胖小鼠腹腔脂肪系數(shù)、肝脂肪含量的影響

由表2 可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠腹腔脂肪系數(shù)、肝脂含量均與之存在顯著性差異（P＜0.05）。與高脂對照組比較，DNJ 灌胃劑量達(dá)到8.0 mg/kg d，雌、雄鼠的腹腔脂肪系數(shù)分別下降43.12%、21.49%（P＜0.05），肝臟脂肪含量分別下降12.76%、11.97%（P＜0.05）。

腹腔脂肪系數(shù)是腹腔脂肪與體重的比，其比值越小表示脂肪分解，反之，意味著脂肪合成受到促進(jìn)作用。腹腔脂肪系數(shù)過大會增加心血管疾病發(fā)生的幾率[19]。脂肪主要聚集于肝臟，而肝脂肪含量與胰島素抵抗綜合癥密切相關(guān)[20-21]。Do 等[11]通過給高脂飲食誘導(dǎo)的雄性肥胖小鼠灌胃DNJ（10 mg/kg bw/d）12 周，結(jié)果表明，DNJ 顯著降低小鼠體重、肝脂含量及附睪、腎、腹膜、腸系膜的脂肪含量。本研究結(jié)果顯示，用8.0 mg/kg bw/d 的DNJ 灌胃高脂飲食的肥胖雌、雄小鼠40 d，能顯著降低小鼠腹腔脂肪系數(shù)、肝脂含量，進(jìn)一步證明DNJ 能有效增加腹腔脂肪的分解，減少肝脂肪含量積累，且有降低胰島素抵抗綜合癥發(fā)生的可能性。

表2 DNJ 對高脂飲食的肥胖小鼠腹腔脂肪系數(shù)、肝脂肪含量的影響（n=10）Table 2 The effect of DNJ on abdominal fat coefficient and content of liver fat in obese mice with high fat diet（n=10）

2.3 DNJ 對高脂飲食肥胖小鼠脂代謝相關(guān)生化指標(biāo)的影響

2.3.1 DNJ 對高脂飲食肥胖小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C 的影響 由表3 可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠TC、TG、HDL-C、LDLC 均與之存在顯著性差異（P＜0.05）。與高脂對照組相比，在實驗劑量范圍內(nèi)，DNJ 使高脂飲食肥胖雌雄鼠的TG、TC、LDL-C 水平呈現(xiàn)降低，HDL-C 含量呈現(xiàn)增加趨勢。當(dāng)DNJ 灌胃劑量達(dá)到8.0 mg/kg d 時，高脂飲食肥胖雌、雄小鼠血清TC 分別下降22.92%，8.81%（P＜0.05）；TG 分別下降23.03%，30.48%（P＜0.05）；LDL-C 分別下降52.78%，59.50%（P＜0.05）；HDL-C 分別上升37.65%，39.53%（P＜0.05），DNJ 對TG、TC、LDL-C、HDL-C 的影響無性別差異（P＞0.05）。

已有研究表明，血脂的變化與體內(nèi)脂肪含量密切相關(guān)，很大程度上反應(yīng)機體脂肪代謝情況[22]。TG、TC 為血脂的主要成分，血脂水平隨其升高而升高，LDL-C、HDL-C 在調(diào)節(jié)血脂水平方面有重要作用，LDL-C 能將TC 輸送至血液，血脂水平隨其含量升高而升高；HDL-C 能促進(jìn)膽固醇代謝，血脂水平隨其含量升高而降低[23]。王玲等[24]建立高脂飲食小鼠肥胖模型，飼喂基礎(chǔ)飼料以模擬肥胖后控制飲食的模式，灌胃DNJ（8.0 mg/kg bw/d）40 d 后，發(fā)現(xiàn)雌、雄小鼠的TC、TG 含量顯著降低，雌鼠HDL-C 含量顯著增加。本研究建立高脂飲食小鼠肥胖模型，并繼續(xù)飼喂高脂飲食以模擬肥胖后控制飲食的模式，在王玲等[24]研究結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證明了DNJ 對血脂水平有明顯的調(diào)控作用，而該DNJ 對不同性別小鼠血脂調(diào)節(jié)存在差異的機理還有待深入研究。上述研究結(jié)果表明，DNJ對高脂飲食肥胖小鼠血脂代謝有一定的調(diào)節(jié)作用，其可能的調(diào)控機制：一方面DNJ 通過促進(jìn)腹腔脂肪的分解，降低腹腔脂肪系數(shù)降低，降低肝臟脂肪合成，以減少肝臟脂肪積累；另一方面DNJ 通過提高血清中HDL-C 水平，HDL-C 運載血液中TG、TC 向肝臟運輸，轉(zhuǎn)化為膽汁酸，降低血清中TG、TC 水平。

2.3.2 DNJ 對高脂飲食肥胖小鼠FFA、內(nèi)脂素、ADP 的影響 由表4 可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠FFA、內(nèi)脂素、ADP 均與之存在顯著性差異（P＜0.05）。與高脂對照組相比，各劑量DNJ可使雌、雄鼠的FFA、內(nèi)脂素呈下降趨勢，ADP 呈增加趨勢，且有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。灌胃DNJ（8.0 mg/kg d）40 d 后，與高脂對照相比，雌、雄小鼠的FFA 分別下降16.25%，15.25%（P＜0.05），內(nèi)脂素分別下降28.38%，23.36%（P＜0.05），且使雌、雄小鼠ADP 含量分別增加了35.53%，26.31%（P＜0.05），即DNJ 機體可以通過調(diào)控ADP 水平來參與脂代謝。在實驗劑量范圍內(nèi)，DNJ 對高脂飲食肥胖小鼠FFA、內(nèi)脂素、ADP 的影響無性別差異（P＞0.05）。

中性脂肪能分解產(chǎn)生FFA，充當(dāng)能量使用。已有研究表明，F(xiàn)FA 不僅是肝臟TG 的合成原料，也與酒精性脂肪肝發(fā)病機制相關(guān)[25]。內(nèi)脂素是一種脂肪細(xì)胞因子，已有研究表明，內(nèi)脂素主要產(chǎn)生于內(nèi)臟，與TC 呈正相關(guān)，與HDL 呈負(fù)相關(guān)，是脂代謝的重要調(diào)控因子[26]。ADP 由脂肪組織分泌，內(nèi)臟脂肪中含豐富的表達(dá)基因，參與脂代謝調(diào)節(jié)[27]。Lindberg 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，血漿低ADP 水平會增加代謝綜合征風(fēng)險。本研究結(jié)果顯示DNJ 降低肥胖小鼠FFA、內(nèi)脂素水平，且增加ADP 含量，表明DNJ 可有效減少肥胖小鼠肝臟TG 合成的原料，保護肝細(xì)胞，使內(nèi)脂素的變化與血清TC 降低、HDL升高的變化結(jié)果一致。

表3 DNJ 對高脂飲食肥胖小鼠血脂水平的影響Table 3 The effect of DNJ on blood lipid levels in obese mice with high fat diet

表4 DNJ 對高脂飲食的肥胖小鼠FFA、內(nèi)脂素、ADP 的影響Table 4 The effect of DNJ on FFA，visfatin and ADP in obese mice with high fat diet

2.4 DNJ 對高脂飲食肥胖小鼠脂代謝相關(guān)酶活性的影響

由表6 可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠FAS、ACC、ACO、CPT-1 均與之存在顯著性差異（P＜0.05）。與高脂對照組相比，灌胃DNJ（8.0 mg/kg d）40 d 后，雌、雄小鼠FAS 活性分別降低19.27%，19.60%（P＜0.05），ACC 活性分別降低30.75%，15.64%（P＜0.05），表明DNJ 可使機體脂肪沉積減少，抑制脂肪合成；而雌、雄小鼠ACO 活性分別升高3.8%，6.4%（P＜0.05），CPT-1 活性分別升高20.4%，17.2%（P＜0.05），表明DNJ 可使脂肪酸β 氧化，有利于脂肪分解。在實驗劑量范圍內(nèi)，DNJ 對高脂飲食肥胖小鼠FAS、ACC、CPT-1、ACO 活性的影響無性別差異（P＞0.05）。

FAS、ACC 的活性增強能加速機體脂肪沉積，對脂肪合成至關(guān)重要[29]。ACO、CPT-1 均能促進(jìn)脂肪酸β 氧化，從而促進(jìn)脂肪的分解[30]。Tsuduki 等[9]等通過給高脂飲食誘導(dǎo)的雄性肥胖小鼠灌胃純DNJ（5 mg/kg bw/d）12 周，結(jié)果表明，DNJ 能顯著降低FAA 含量，顯著增加ADP，內(nèi)脂素水平、CPT、ACO 活力顯著增加。而本研究結(jié)果與Tsuduki 等[9]研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果表明，DNJ 一方面通過抑制與脂肪合成有關(guān)的FAS、ACC 活性使肥胖小鼠體內(nèi)脂肪合成受阻，減少TG積累；另一方面通過增加與脂肪氧化分解密切相關(guān)的CPT-1 活性，加速脂肪酸的β 氧化，促進(jìn)脂肪分解，從而達(dá)到控制高脂飲食肥胖小鼠血脂水平的目的。

表5 DNJ 對高脂飲食肥胖小鼠肝臟中FAS、ACC、ACO、CPT-1 的影響Table 5 The effects of DNJ on FAS，ACC，ACO，CPT-1 in liver of obese mice with high fat diet

3 結(jié)論

DNJ 是桑葉中含量較高的一種生物堿。近年來國內(nèi)外研究表明，DNJ 具有調(diào)節(jié)血脂的作用。本研究結(jié)果表明，DNJ 可以通過控制脂肪因子分泌及脂代謝相關(guān)酶活來抑制脂肪合成，促進(jìn)其分解，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控高脂飲食肥胖小鼠脂代謝的目的。同時，DNJ 對不同性別小鼠脂代謝的調(diào)節(jié)作用無性別差異。