介質特性對超聲波鈍化芒果多酚氧化酶和過氧化物酶的影響

劉 洪 周亨樂 陳 磊，2 邢亞閣 劉曉翠 畢秀芳*

（1 西華大學食品與生物工程學院 四川省食品生物技術省高校重點實驗室 成都610039 2 宜賓西華大學研究院 四川宜賓 644000）

超聲波是一種極具發(fā)展前途的非熱殺菌技術，其中頻率在20～100 kHz，功率密度為10～1 000 W/cm2的高場強超聲波，在食品加工中最為常用[1]。近年來，超聲波作為非熱加工技術在食品工業(yè)中的應用得到越來越多學者的關注[1]。目前，超聲技術被應用于多種果蔬汁加工中。超聲波處理果蔬汁不僅能達到較好的殺菌效果，而且還能有效鈍化酶的活性[2]。超聲波對酶的鈍化作用主要是因其引起的空化效應，形成空化氣泡，并在氣泡破裂時產生極高的溫度和壓力，釋放出大量的能量，而導致酶分子的空間構象發(fā)生改變[3]。

芒果是著名的熱帶水果，其果肉細膩、風味獨特、品種繁多、種植地域廣，又被稱為“熱帶水果之王”[4]。成熟的芒果果實中糖分和蛋白質含量分別約為12%和0.6%，還含有豐富的果膠，pH 值為3.40～4.80[5]。目前，芒果除鮮食外，大部分被加工成芒果汁、芒果原漿和芒果罐頭等。芒果中多酚物質含量豐富，在加工過程中極易受到機械損傷，導致其亞細胞結構被破壞，使類囊體中釋放的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）與液泡中釋放的酚類物質接觸，從而發(fā)生褐變反應，影響其外觀風味及營養(yǎng)物質[6]。除PPO 外，引起芒果褐變的酶主要還有過氧化物酶（Peroxidase，POD）[7]。前人研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理對PPO 和POD 有顯著鈍化效果[8-9]。

超聲波對食品內源酶的鈍化效果主要受超聲波作用參數(shù)、環(huán)境條件和介質特性等影響。前人的研究主要集中于超聲波鈍酶處理參數(shù)（功率、時間、溫度、間歇比等）的優(yōu)化[10]，而關于環(huán)境條件及介質特性對鈍酶效果的影響研究較少。其中，介質中碳水化合物、蛋白質等組分的含量可能是影響超聲波鈍酶效果的重要因素。一般而言，由于食品中其它成分的存在對酶具有保護作用，所以導致單一緩沖溶液中的酶比在實際食品體系中更容易鈍化。Lopez 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在介質中添加抗壞血酸、糖等成分能提高脂肪氧合酶（LOX）的穩(wěn)定性，從而降低超聲波的鈍化效果，而加入氯化鉀對超聲波鈍酶效果影響不大。本文通過研究超聲波對不同糖含量、蛋白質添加量，pH 值及介質黏度的芒果粗酶液的鈍化效果，為芒果汁鈍酶加工提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：攀枝花地區(qū)主栽的凱特芒果，產于攀枝花市鹽邊縣。選取無機械傷，無病蟲害，成熟度適中、果重均勻的芒果。

白砂糖，上海信冉食品有限公司；檸檬酸，鄭州潤杰化工產品有限公司；大豆蛋白胨，北京鴻潤寶順科技有限公司；卡拉膠，騰州市香凌生物工程有限責任公司；黃原膠，山東優(yōu)雪化工科技有限公司；阿拉伯膠、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），浙江多味化工食品有限公司；商品蘋果果膠、柑桔皮果膠、鄰苯二酚、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；過氧化氫（30%），天津市致遠化學試劑有限公司；愈創(chuàng)木酚，國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純級，成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-IID 超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；WFJ7200 分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；MC-00000411pH 計，成都世紀方舟科技有限公司；糖度計，廣州市愛宕科學儀器有限公司；MCR302 流變儀，奧地利安東帕公司；Heraeus multifuge X1R 臺式高速大容量冷凍離心機，賽默飛世爾科技公司；GL124-1SCN 電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；MJBL25B26 多功能家用攪拌機，美的集團；HH-6 水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 芒果汁的制備 將新鮮芒果切成小塊，加入3 倍質量水，打漿，4 層紗布過濾2 次，制得芒果汁。芒果汁經測定其糖度為5.5 Birx，pH 值為5.7，黏度為25.7 mPa·s。

1.3.2 粗酶液的制備 將新鮮芒果去皮去核后倒入食物攪拌機，以1∶3（g/mL）的比例加入0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH 6.50）打成勻漿，4 層紗布過濾2次，加入4%的PVPP 后靜置聚沉12 h。聚沉液在4 ℃，8 000 r/min 條件下離心25 min，上清液即為粗酶液。粗酶液經測定其糖度為4.4 Brix，pH 值為5.2，黏度為15.2 mPa·s。

1.3.3 粗酶液介質特性的調整 介質糖含量調整，添加蔗糖至糖度分別為5，10，15，20 Brix；介質蛋白質含量調整，分別添加0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的大豆蛋白胨；介質pH 調整，加入檸檬酸，至pH 分別為3，4，5；介質黏度調整，通過分別向粗酶液加入卡拉膠、蘋果果膠、柑桔皮果膠、CMC-Na、黃原膠、阿拉伯膠等6 種增稠劑，至黏度為17.6，19.4，22.7，25.4，27.1 mPa·s。

1.3.3 酶活性的測定 粗酶液酶活測定：PPO 活性的測定參照Tan 等[2]的方法，并略加修改。向試管中加入3 mL 0.1 mol/L 的鄰苯二酚溶液，并于30°C 保溫3 min，然后加入0.4 mL 粗酶液，迅速搖勻后，倒入比色皿中，于420 nm 波長下測定吸光值，每10 s 記錄1 次吸光值，連續(xù)記錄60 s。以向底物中添加0.4 mL 磷酸緩沖液為吸光值空白調零。

POD 活性的測定參照文獻[12]的方法。向試管中加入3 mL 1.0%愈創(chuàng)木酚和0.2 mL 1.5%過氧化氫于30°C 保溫3 min，加入0.2 mL 粗酶液，迅速搖勻后，倒入比色皿中，于470 nm 波長下測定吸光值，每20 s 記錄1 次吸光度值，連續(xù)記錄100 s。以向底物中添加0.2 mL 磷酸緩沖液為吸光值空白調零。

芒果汁酶活測定：芒果汁中加入4%的PVPP，并于4°C，8 000 r/min 條件下離心25 min，上清液即為酶液，按照上述步驟測定。

PPO 和POD 的一個酶活力單位（U）定義為每分鐘吸光值增加0.1。并利用公式（1）計算殘余酶活力：

式中，At——處理后樣品酶活力；A0——未處理樣品初始酶活力。

1.3.4 超聲波處理 取30 mL 粗酶液或芒果汁于50 mL 燒杯中進行超聲處理，超聲波處理時水浴溫度為45°C，超聲波功率密度為799.31 W/cm2，脈沖間隔為2 s 開2 s 關，探頭浸入液面深度為1.5 cm，超聲波處理時間為15 min。

1.3.5 數(shù)據統(tǒng)計分析 數(shù)據采用方差分析（ANOVA），使用軟件Origin8.5（美國Microcal 公司）進行統(tǒng)計并繪圖。α=0.05，所有試驗重復2 次。

2 結果與分析

2.1 超聲波對粗酶液和芒果汁鈍酶效果的比較

在45°C，799.31 W/cm2，15 min 條件下，超聲處理對粗酶液和芒果汁中PPO 和POD 的鈍化效果如圖1 所示。超聲波使粗酶液和芒果汁中PPO活性分別下降了40.31%，15.87%，POD 活性分別下降了64.50%，21.82%。結果表明，超聲波對芒果汁中PPO 和POD 的鈍化效果顯著低于對粗酶液的鈍化效果。這種差異可能是由于粗酶液和芒果汁的保護性組分含量和介質黏度不同所致。相關研究表明，處理介質特性的差異會影響超聲波空化效應傳遞效果，從而影響超聲波鈍酶效果[13]。

圖1 超聲波處理對芒果汁和粗酶液中PPO和POD 的鈍化效果Fig.1 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD activity in mango juice and crude enzyme solution

2.2 不同組分對超聲波鈍酶效果的影響

2.2.1 糖含量對超聲波鈍酶效果的影響 在45℃，799.31 W/cm2，15 min 條件下，超聲波處理對不同糖含量的粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果如圖2 所示。不同糖含量對未處理粗酶液酶活性無顯著性影響（P＞0.05）。將粗酶液糖含量從4.4 Brix提高至5 Brix 和10 Brix，經超聲波處理后，隨著糖含量的升高，PPO 和POD 的超聲波鈍化率顯著降低（P＜0.05）。與未調整組相比，糖含量為5 Brix和10 Brix 的粗酶液中PPO 超聲波鈍化率分別降低了20.67%和29.36%，POD 超聲波鈍化率分別降低了40.34%和46.22%。繼續(xù)提高粗酶液中的糖含量至15 Brix 和20 Brix，PPO 和POD 的超聲波鈍化率未進一步降低（P＞0.05）。結果表明在一定范圍內，隨著糖含量的提升，體系對超聲波鈍化中PPO 和POD 的保護效果隨之提升。Lopez 等[11]發(fā)現(xiàn)通過向LOX 酶液中添加一定量的蔗糖或葡萄糖（2.9%～10.9%）可以降低壓熱超聲（MTS，20 kHz，71 ℃，10 min）對LOX 的鈍酶效果，兩種糖都能提高LOX 對MTS 的耐受性。Vercet 等[14]通過向橙汁體系和檸檬酸鹽緩沖液中添加糖分（3%葡萄糖、3%果糖、6%蔗糖），發(fā)現(xiàn)這些糖分可以使果膠甲酯酶（PME）在MTS（24 kHz，72～82 ℃，5 min）下的D 值增加3 倍，顯著增強了PME 的MTS 穩(wěn)定性。這可能是由于添加糖分增加了酶蛋白質的穩(wěn)定性，從而不易被超聲波破壞[14]。

圖2 超聲波處理對不同糖含量粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果Fig.2 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD activity in crude enzyme solution with different sugar content

2.2.2 蛋白添加量對超聲波鈍酶效果的影響 在45°C，799.31 W/cm2，15 min 條件下，超聲波處理對不同蛋白添加量的粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果如圖3 所示。不同蛋白添加量對未處理粗酶液酶活性無顯著影響（P＞0.05）。向粗酶液中添加0.5%和1.0%的蛋白，經超聲波處理后，隨著蛋白添加量的增加，PPO 和POD 的超聲波鈍化率發(fā)生顯著性降低（P＜0.05）。與未調整組相比，0.5%和1.0%的蛋白添加量粗酶液中PPO 和POD 鈍化率分別降低了24.55%，42.36%和30.9%，47.19%。繼續(xù)提高粗酶液中的蛋白添加量至1.5%，2.0%和2.5%，PPO 和POD 的超聲波鈍化率未進一步降低（P＞0.05）。結果表明一定量范圍內，蛋白添加可以抑制超聲波的鈍酶效果，且該抑制效果與蛋白添加量呈正相關。Tarun 等[15]發(fā)現(xiàn)添加大豆蛋白（1%，2%）使超聲波（1.0 W/cm2）對脲酶的鈍化率降低18%。蛋白質可以降低超聲波對葡萄球菌[16]、大腸桿菌[17]的殺滅效果，可能是由于蛋白質可以影響超聲波的傳遞，從而減少其空化作用，影響超聲波的殺菌效果[17]。本試驗中蛋白質抑制超聲波鈍酶效果也可能是因為超聲波空化作用受到限制，減少了能量的釋放，從而使得超聲鈍酶效果降低。

圖3 超聲波處理對不同蛋白添加量的粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果Fig.3 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD activity in crude enzyme solution with different protein addition

2.2.3 pH 對超聲波鈍酶效果的影響 在45°C，799.31 W/cm2，15 min 條件下，超聲波處理對不同pH 的粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果如圖4 所示。在4.0～5.2 范圍內，pH 對未處理粗酶液酶活性無顯著影響（P＞0.05），經超聲波處理后，pH 4.0 和pH 5.0 的粗酶液中PPO 和POD 鈍化率與未調整組相比分別降低了22.73%，27.19%和41.32%，34.58%。繼續(xù)降低粗酶液pH 值至3.0，未處理的PPO 和POD 活性顯著降低（P＜0.05），比未調整組粗酶液的活性分別降低了21.57%和13.69%；經超聲波處理后，與pH 值為4.0 的粗酶液相比，PPO 和POD 的超聲波鈍化率未發(fā)生顯著變化。結果表明在一定范圍內，降低pH 值可以抑制超聲波的鈍酶效果，pH 3.0 的酸性環(huán)境可直接抑制PPO 和POD 的活性。相反的結果被前人所報道，Thakur 等[18]研究了超聲波（200 W，10 min）對不同pH 值的大豆粉懸浮液中LOX 活性的影響，發(fā)現(xiàn)當pH＞5 時，超聲波對LOX 的活性影響較小，而pH 值在4.0～5.0 時，相同的超聲波條件可使LOX活性降低70%～85%。Lopez 等[11]也發(fā)現(xiàn)隨著pH 值的升高，LOX 的MTS（2.64 MHz，67.5～76.3 ℃，10 min）穩(wěn)定性提高。不同結果可能是由于酶的種類、來源以及最適反應pH 值不同所致。PPO 和POD分別是含銅和鐵的酶蛋白，其活性與pH 值密切相關，當其處于高酸性環(huán)境中，蛋白質可能發(fā)生變性從而導致酶活性降低，這可能是本研究中pH 3.0的未處理粗酶液中PPO 和POD 活性降低的原因。超聲波處理時，當PPO 和POD 接近其最適反應pH 值（6.5）時，其活性部位的酸性或堿性氨基酸側鏈基團發(fā)生解離，影響酶的活化和酶與底物的親和力，從而更易被超聲波鈍化[19]，這可能是本研究中pH 值越高，超聲波鈍酶效果越好的原因。

圖4 超聲波處理對不同pH 粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果Fig.4 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD activity in crude enzyme solution with different pH

2.3 同介質黏度對超聲波鈍酶效果的影響

在45°C，799.31 W/cm2，處理15 min 條件下，超聲波對不同黏度粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果如圖5 所示。本研究范圍內，黏度的改變對未處理粗酶液酶活性無顯著影響（數(shù)據未顯示，P＞0.05）。隨著黏度增加，PPO 和POD 超聲波鈍化率發(fā)生顯著性降低（P＜0.05），與未調整組（黏度15.2 mPa·s）相比，使用卡拉膠增稠后，黏度為27.1 mPa·s 粗酶液中PPO 和POD 鈍化率分別降低了27.14%和29.96%。6 種增稠劑在相同黏度下的超聲鈍酶效果差異不顯著（P＞0.05）。結果表明，增加介質黏度可以抑制超聲波的鈍酶效果，不同增稠劑增稠作用對超聲波鈍酶效果影響不大。吳虹等[20]發(fā)現(xiàn)使用超聲波（100 W）進行脂肪酶催化轉酯反應時，處于高黏度反應液中的酶活力僅為81%，顯著低于低黏度組。Raviyan 等[21]發(fā)現(xiàn)超聲波（25 kHz，55 ℃）對緩沖液中PME 的鈍化效果要顯著高于對番茄汁體系中PME 的鈍化效果。Vercet等[14]發(fā)現(xiàn)橙汁體系的PME 超聲波抗性是其在檸檬酸鹽緩沖液的25 倍，這可能是由于果膠的存在。介質會影響超聲波的傳遞和能量分布，高黏度的介質使聲波傳遞困難，導致能量分布不均、消耗大。果汁勻漿的黏度一般高于緩沖液的黏度，高黏度的果汁超聲產生的空化數(shù)量少，可能降低超聲波的鈍酶效果[13]。

圖5 超聲波處理對不同黏度粗酶液的鈍酶效果Fig.5 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD in crude enzyme solution with different viscosity

3 結論

本研究結果表明，增加糖分、蛋白質和介質黏度以及降低pH 可顯著降低超聲波對芒果PPO 和POD 的鈍化效果。證實了食品組分和介質黏度等介質特性會影響超聲波鈍酶效果，為芒果汁的超聲波生產提供一定理論支撐。