云南部分地區(qū)黑山羊的芽囊原蟲分子檢測及基因分型

謝世臣，鄒揚(yáng)，李朝,，楊建發(fā)，朱興全，盛金良

(1 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/甘肅省獸醫(yī)寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046；3 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

芽囊原蟲(Blastocystis)是一種較為常見的人和動(dòng)物體內(nèi)消化道寄生蟲。自1912年首次發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲以來，關(guān)于芽囊原蟲的分類歸屬一直飽受爭議，芽囊原蟲曾一度被認(rèn)為是鞭毛蟲的包囊，隨后的研究又歸納為植物和酵母菌以及真菌等物種，直到1967年Zierdt等[1]才將芽囊原蟲歸類為原蟲。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，芽囊原蟲的宿主譜十分廣泛，從人和非人類靈長動(dòng)物、鳥類、爬行類和兩棲類動(dòng)物體內(nèi)均檢測分離到芽囊原蟲的存在。其流行呈世界性分布，且具有極高的地理差異性，在貧窮落后地區(qū)及發(fā)展中國家、熱帶及亞熱帶地區(qū)有較高的感染率[2]。

有關(guān)芽囊原蟲的致病性也存有一定的分歧[3]。雖然沒有證據(jù)表明，人和動(dòng)物產(chǎn)生的腹痛、腹瀉等臨床癥狀與感染芽囊原蟲有直接關(guān)聯(lián)。但在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，芽囊原蟲通過污染水源和食物能夠感染其他動(dòng)物和人類，所以，芽囊原蟲對低齡動(dòng)物和免疫低下的動(dòng)物仍具有一定的潛在致病性。在一些案例中，人和動(dòng)物糞便中能夠檢出大量的芽囊原蟲卵囊。且報(bào)道指出，芽囊原蟲的感染與腸應(yīng)激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)具有一定的聯(lián)系。

為了闡明云南地區(qū)黑山羊感染芽囊原蟲的現(xiàn)狀和風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步評估當(dāng)?shù)鼐用竦纳瞽h(huán)境中芽囊原蟲可能存在的公共衛(wèi)生安全隱患。本研究將基于芽囊原蟲SSU-rRNA基因，根據(jù)分子生物學(xué)方法對采集自云南五個(gè)地區(qū)的907份黑山羊樣品進(jìn)行分析，研究當(dāng)?shù)睾谏窖虻难磕以x的感染情況和基因亞型種群結(jié)構(gòu)。為當(dāng)?shù)仡A(yù)防芽囊原蟲的傳播提供科學(xué)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

自2017年8月—10月份，從云南省楚雄州、西雙版納、麗江等3個(gè)州市5個(gè)地區(qū)共12個(gè)農(nóng)場采集到云南黑山羊糞便907份，每只動(dòng)物采集糞便5～10 g，對應(yīng)放置于標(biāo)記動(dòng)物編號的15 mL采樣管中，同時(shí)記錄動(dòng)物的性別及年齡大小，將裝有糞便樣品的的收集管置于裝有冰袋的泡沫盒中并轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；用2.5%重鉻酸鉀溶液完全浸泡并保存于4 ℃冰箱待后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 樣本的預(yù)處理及DNA的提取

取約3 g糞便樣品，使用滅菌雙蒸水與超高速離心機(jī)洗去重鉻酸鉀，直至溶液清澈透亮。將預(yù)處理后的糞便，按照E.Z.N.A.Stool DNA Kit (OMEGA，USA) 試劑盒說明書提取DNA，得到80 μL的提取物，并利用Nano-Drop分光光度計(jì)測定提取物OD260/OD280，判定其純度和濃度。所有DNA均儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。

1.3 芽囊原蟲的檢測

根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]，在西安擎科生物公司合成引物(BhrDR-F1：5′-GAGCTTTTTAACTGCAACAACG-3′，GR1：5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′)，按照實(shí)驗(yàn)室要求配制并分裝引物。25 μL PCR體系如下：取14.25 μL滅菌雙蒸水，2 μL的dNTPs，2.5 μL 10×Buffer (Mg2+free)，1.5 μL的MgCl2試劑，上下游引物各1 μL，模板2 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性：94 ℃、5min，變性：94 ℃、45 s，退火：65 ℃、45 s，延伸：72 ℃、1min，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，再延伸：72 ℃、10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用1×TAE緩沖液配制含有濃度約為1 μg/mL的溴化乙錠(EB)的1.5%的瓊脂糖凝膠。進(jìn)行電泳鑒定。通過凝膠成像儀觀測結(jié)果并作記錄，將鑒定為PCR擴(kuò)增陽性的PCR產(chǎn)物送至西安擎科生物有限公司進(jìn)行單向測序。

1.4 芽囊原蟲的基因亞型分型

對校準(zhǔn)和拼接后的序列，用軟件Mega 7.0 (https://www.megasoftware.net/)采用方法為鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)對芽囊原蟲陽性的核酸序列進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)化樹。選用Kimura 2-parameter模型，Bootstrap分析(采用1000個(gè)重復(fù))用于評估系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性，其它相關(guān)參考序列依照已報(bào)道的文獻(xiàn)從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用軟件SPSS 20.0 (SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進(jìn)行處理。使用χ2來分析云南地區(qū)黑山羊的芽囊原蟲在性別、年齡、區(qū)域間的感染率差異，當(dāng)P<0.05則被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑山羊中芽囊原蟲的流行情況

通過對907份黑山羊糞便進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，經(jīng)過電泳鑒定、測序鑒定，成功擴(kuò)增出375份陽性DNA，PCR擴(kuò)增結(jié)果約600 bp(圖1)，總體檢出率為41.3%。

注：M：DNA Marker 2000；-：陰性；1表示陽性；2-8：從黑山羊糞便提取的樣本DNA圖1 黑山羊芽囊原蟲SSU rRNA擴(kuò)增結(jié)果

針對本研究檢測結(jié)果對黑山羊不同地區(qū)、性別和年齡段等因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表1)。

表1 不同年齡、性別和地區(qū)間云南黑山羊的流行病學(xué)情況

西雙版納勐臘縣地區(qū)，128份樣本中成功鑒定出116份陽性，陽性率為90.6%，陽性率最低的地區(qū)為牟定縣20.7%(30/145)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，五個(gè)地區(qū)間感染率存在顯著性差異(χ2=181.73,df=4,P<0.001)。而且，本研究發(fā)現(xiàn)，芽囊原蟲感染率與年齡具有相關(guān)性，本試驗(yàn)在年齡間也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.52,df=2,P<0.001)。我們發(fā)現(xiàn)在個(gè)別農(nóng)場中，低齡動(dòng)物(1-12月齡)，呈現(xiàn)出完全感染，高齡動(dòng)物(M≥24月)也存在普遍感染的現(xiàn)象。除此之外，本試驗(yàn)在性別間也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.69,df=1,P=0.001)。在雄性黑山羊中感染率為45.0%(285/633)，高于雌性黑山羊的32.9%(90/274)(表1)。

2.2 芽囊原蟲的基因亞型分布情況

本研究中，通過對所有375份陽性樣本在線Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對發(fā)現(xiàn)，其中有一株DSJ-11與MH201341(ST5)同源性為100%；一株DSJ-281與MF186664(ST14)同源性為100%；一株MHZ-13與MG831504(ST10)同源性為100%；其余的陽性DNA中，有157株與MG831460同源性高達(dá)99%，有127株與MG831504同源性為99%，還有82株與LT594969同源性為99%。此外，本研究發(fā)現(xiàn)并命名4個(gè)新亞型ST-novel 1一株，新亞型ST-novel 2一株，新亞型ST-novel 3三株，新亞型ST-novel 4一株。最后得到ST5共158份，ST10共128份，ST14共83份。

通過對不同地區(qū)間ST5、ST10和ST14分布情況分析發(fā)現(xiàn)，ST5是試驗(yàn)地區(qū)的優(yōu)勢基因亞型。各基因亞型在地區(qū)間的分布情況見圖2。

圖2 芽囊原蟲基因亞型在各地區(qū)的分布

我們所分離出的4株新基因亞型ST-novel 中，ST-novel 1和ST-novel 2分離于武定縣，ST-novel 3和ST-novel 4分離于西雙版納勐臘縣。參考ST1-17的序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示，ST-novel 2和ST-novel 3、ST-novel 1和ST-novel 4分別成支，而且這4種基因亞型在Blast篩選結(jié)果中差異性均>5%，單獨(dú)位于進(jìn)化樹的一個(gè)分支上(圖3)。

注：▲為本研究鑒定出的新命名的基因亞型圖3 本研究中芽囊原蟲系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論

芽囊原蟲(Blastocystis)是一類流行廣泛的寄生性腸道原蟲。其分布呈世界性，在發(fā)達(dá)國家能達(dá)到1.5%～20%,在發(fā)展中國家能達(dá)到30%～60%[5]。芽囊原蟲由于基因的遺傳多樣性，現(xiàn)被分為17個(gè)亞型，記為ST1-17。其中，ST1-9被認(rèn)為存在人獸共患致病風(fēng)險(xiǎn)，而ST10-17只在動(dòng)物和水中所檢測到，認(rèn)為公共衛(wèi)生意義不大。過去的大約90%的報(bào)道都認(rèn)為，ST1和ST2是美國的優(yōu)勢亞型，ST1和ST3是澳大利亞、歐洲和亞洲東南部的優(yōu)勢亞型，ST4則是歐洲的優(yōu)勢亞型。且在不同的地域或者國家內(nèi)，ST5至ST9也在人體內(nèi)也被檢測到。但至今為止，尚未報(bào)道有ST10至ST17在人體內(nèi)所檢測到，但ST10是最常見于牛、羊和駱駝等反芻動(dòng)物中的。

在我國曾進(jìn)行的腸道原蟲感染情況調(diào)查中，芽囊原蟲的感染率在西南地區(qū)維持在較高水平，西南城市地區(qū)為4.0%，西南農(nóng)村地區(qū)為32.6%[6]。全國范圍內(nèi)的感染率比較發(fā)現(xiàn)，上海[7]地區(qū)的人感染率為2.95% (88/2984)，新疆人[8]感染率為0.7% (2/26886)，深圳人[9]感染率為0.4% (6/1518)。國內(nèi)外有關(guān)芽囊原蟲感染羊的報(bào)道較少，其中陜西省山羊[10]感染率58.0% (458/789)，安徽省[11]綿羊感染率為6.38% (22/345)，山羊?yàn)?.26% (2/781)。在國外的一些報(bào)道中，芽囊原蟲也表現(xiàn)出了較大的地理差異性，伊朗[12]地區(qū)人患病率為14.35% (69/481),土耳其地區(qū)[13]人患病率為0.54% (275/50185)，泰國地區(qū)[14]人患病率13.5% (110/814)，馬來西亞地區(qū)[15]兒童患病率為25.7% (77/300)，山羊感染芽囊原蟲的感染率為30.9%。

本研究中，云南黑山羊的芽囊原蟲感染率為41.3%，顯著高于西南農(nóng)村地區(qū)報(bào)道的32.6%，其中，尤其以勐臘縣磨憨鎮(zhèn)高達(dá)90.6%的感染率。造成這一結(jié)果的原因可能是：(1)：西雙版納勐臘縣靠近國界線，與老撾接壤，進(jìn)出口動(dòng)物或人類可能攜帶，進(jìn)而擴(kuò)大傳播。(2)：西雙版納作為云南地區(qū)養(yǎng)殖動(dòng)物最多的幾個(gè)地區(qū)之一，動(dòng)物數(shù)量非常龐大；且靠近赤道，每年雨水豐富，地理因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。(3)：同時(shí)西雙版納也是云南旅游勝地，每年吸引到的游客有數(shù)百萬，芽囊原蟲作為一種世界性廣泛分布的寄生蟲，可以潛伏在人或動(dòng)物體內(nèi)，隨著宿主動(dòng)物活動(dòng)范圍的擴(kuò)大而傳播。(4)：推測主要原因可能是試驗(yàn)農(nóng)場衛(wèi)生習(xí)慣不良，經(jīng)糞口途徑飲用或食用受污染的水或食物。(5)：樣本量太少，采樣地單一所造成的誤差。

由基因亞型分布情況中得知，本研究的5個(gè)地區(qū)中，除了牟定縣的ST10患病數(shù)高于ST5，其余地區(qū)ST5均是試驗(yàn)地區(qū)的優(yōu)勢基因亞型，提醒我們要重視ST5可能引起的人獸共患風(fēng)險(xiǎn)[16]。在國內(nèi)山羊感染芽囊原蟲的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，陜西省感染芽囊原蟲的山羊中以ST10作為優(yōu)勢基因型，其次為ST14、ST5和ST1等。安徽省和山東省感染芽囊原蟲的山羊都以ST10為主要基因型，江蘇省感染羊群中ST5為優(yōu)勢基因型。此外，有報(bào)道稱ST6是亞洲各地所感染的一種普遍基因型，但本研究并沒有發(fā)現(xiàn)ST6，推測可能與實(shí)驗(yàn)樣本量和地區(qū)特異性有關(guān)。在馬來西亞的山羊感染芽囊原蟲的案例中，其優(yōu)勢基因型為ST1，其次為ST6、ST7和ST3，這一數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了芽囊原蟲的傳播存在極高的地理差異性。

在進(jìn)化樹分析中，ST-novel 2和ST-novel 3、ST-novel 1和ST-novel 4分別成支，而且這4種基因亞型在Blast篩選結(jié)果中差異性均>5%，單獨(dú)位于進(jìn)化樹的一個(gè)分支上，由此，推測這4種基因亞型可能成為新的基因亞型。至于本研究中新發(fā)現(xiàn)的這四種基因亞型是否有人獸共患的風(fēng)險(xiǎn)，需要后續(xù)更多地試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。