阿莫西林在雞蛋中的殘留消除規(guī)律研究

?？? 楊絨娟 李召斌 張文君 趙永峰 晏磊 周德剛

摘要?[目的]考察阿莫西林可溶性粉在雞蛋中的殘留消除規(guī)律，確定其休藥期，防止其在臨床上的不合理使用。[方法]選取2組健康成年已開(kāi)產(chǎn)蛋雞分別灌服不同廠家的阿莫西林，劑量均為100?mg/kg體重，連續(xù)用藥5?d。給藥期間至給藥后14?d進(jìn)行取樣，每日每組取雞蛋15枚，使用ELISA試劑盒進(jìn)行阿莫西林殘留檢測(cè)，并用WT1.4軟件計(jì)算阿莫西林的休藥期。[結(jié)果]2組均在停藥后第1天藥物濃度達(dá)到最高值，阿莫西林在雞蛋中的休藥期分別為12.74和12.72?d。[結(jié)論]阿莫西林在雞蛋中的殘留時(shí)間較長(zhǎng)，且不同廠家的阿莫西林在雞蛋中的休藥期無(wú)差異。

關(guān)鍵詞?阿莫西林;雞蛋;藥物殘留;休藥期

中圖分類(lèi)號(hào)?S859.84文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）07-0110-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.032

Study?on?the?Residual?and?Elimination?Laws??of?Amoxicillin?Residues?in?Eggs

SANG?Kana，?YANG?Rongjuan，?LI?Zhaobin?et?al

（Luoyang?Huizhong?Animal?Medicine?Co.，Ltd.，National?Research?Center?for?Veterinary?Medicine，Luoyang，Henan?471003）

Abstract?[Objective]?To?investigate?the?rule?of?residual?elimination?of?amoxicillin?in?eggs，?determine?the?withdrawal?period?and?prevent?its?unreasonable?use?in?clinic.?[Method]?Two?groups?of?healthy?adult?laying?hens?were?fed?with?amoxicillin?from?different?manufacturers?at?a?dose?of?100?mg/kg?body?weight?for?5?days.?Samples?were?taken?during?the?administration?period?to?14?days?after?the?administration，?15?eggs?were?taken?from?each?group?daily.?ELISA?kit?was?used?to?detect?the?amoxicillin?residues?and?WT1.4?software?to?calculate?the?withdrawal?period.?[Result]?Drug?concentration?in?the?both?groups?reached?the?highest?values?on?the?first?day?after?discontinuation.?The?withdrawal?period?of?amoxicillin?in?eggs?in?two?groups?was?12.74?and?12.72?d?respectively.[Conclusion]?Amoxicillin?has?a?longer?residual?time?in?eggs，?and?there?was?no?significant?difference?in?the?drug?withdrawal?period?between?the?different?manufacturers?of?amoxicillin?in?eggs.

Key?words?Amoxicillin;Eggs;Drug?residue;Withdrawal?period

作者簡(jiǎn)介??？龋?990—），女，河南駐馬店人，獸醫(yī)師，碩士，從事獸醫(yī)藥理毒理研究、獸藥殘留檢測(cè)等工作。

通信作者，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，從事新獸藥研發(fā)與開(kāi)發(fā)工作。

收稿日期?2019-10-08;修回日期?2019-10-25

阿莫西林（Amoxicillin）又名羥氨芐青霉素，是一種最常用的青霉素類(lèi)廣譜β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，具有殺菌能力強(qiáng)、口服吸收好、血藥濃度高且不受食物影響的特點(diǎn)[1]，在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛。在實(shí)際養(yǎng)殖臨床用藥中的不規(guī)范使用，導(dǎo)致阿莫西林在動(dòng)物各組織中的殘留，一方面引起細(xì)菌耐藥菌株的產(chǎn)生，另一方面攝入青霉素殘留超標(biāo)的動(dòng)物可食性組織，經(jīng)胃腸道吸收容易造成過(guò)敏反應(yīng)[2]和其他對(duì)身體的潛在危害。

阿莫西林殘留量檢測(cè)是當(dāng)前中國(guó)、歐盟和北美等國(guó)家對(duì)動(dòng)物性食品的必檢項(xiàng)目之一[3]。大多數(shù)國(guó)家均對(duì)阿莫西林在動(dòng)物食品中的最高殘留限量（MRLs）作出了規(guī)定。2002年，原農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告規(guī)定了動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量（maximumresidue?limits，MRLs），其中阿莫西林在組織中的MRLs為50?μg/kg，在牛奶中的MRLs為10?μg/kg[4];日本厚生省頒布的《食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留限量》則規(guī)定阿莫西林在雞組織中MRLs為50?μg/kg，在雞蛋中為10?μg/kg[5];歐盟規(guī)定阿莫西林和氨芐西林在所有動(dòng)物性食品中的MRLs為50?μg/kg，在牛奶中為4?μg/kg[6]。

筆者研究了阿莫西林在雞蛋中的殘留消除規(guī)律，規(guī)范阿莫西林在養(yǎng)殖中的科學(xué)合理合規(guī)使用，分析其不合理使用及濫用后對(duì)人類(lèi)健康的潛在危害，旨在為保障動(dòng)物源性食品和人類(lèi)生命健康提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?試驗(yàn)藥物。

阿莫西林可溶性粉，有效成分30%，包裝規(guī)格100?g/袋，生產(chǎn)廠家為河南某公司;

阿莫西林可溶性粉，有效成分30%，包裝規(guī)格100?g/袋，生產(chǎn)廠家為山東某公司。

1.1.2?試驗(yàn)動(dòng)物。

健康成年已開(kāi)產(chǎn)蛋雞90只，28周齡左右，體重為（1.80±0.20）kg。試驗(yàn)前預(yù)飼14?d，飼喂不含任何抗菌藥物的全價(jià)飼料，自由飲水。

1.1.3?試驗(yàn)儀器與耗材。

電子天平，規(guī)格0.1～1?000.0?g，為常熟市金羊砝碼儀器有限公司產(chǎn)品;阿莫西林殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，批號(hào)20190614，購(gòu)自北京勤邦生物技術(shù)有限公司;其他耗材有腳標(biāo)、5?mL注射器灌胃管等。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?試驗(yàn)分組。

成年健康已開(kāi)產(chǎn)蛋雞90只，利用EXCEL隨機(jī)數(shù)字生成器分別對(duì)90只蛋雞隨機(jī)選擇，分為3組，每組30只。其中Ⅰ組為試驗(yàn)組給予河南某公司的阿莫西林可溶性粉，Ⅱ組為對(duì)照組給予山東某公司的阿莫西林可溶性粉，Ⅲ組為空白對(duì)照組，不給藥，正常飼喂不含任何抗菌藥物的全價(jià)飼料。對(duì)所有雞只進(jìn)行給藥前稱(chēng)重，依據(jù)稱(chēng)重結(jié)果進(jìn)行給藥。

1.2.2?給藥方法。

阿莫西林按100?mg/kg體重劑量口服給藥，每日2次，連用5?d。投藥時(shí)將阿莫西林可溶性粉用水配成凈含量為40?mg/mL的水溶液。藥物現(xiàn)配現(xiàn)用，具體給藥方法見(jiàn)表1所示。

1.2.3?樣品收集與編號(hào)。

雞蛋樣品均在每天17：30—18：00收集，在收集后及時(shí)保存于4?℃冰箱中。收集日期為給藥期間（5?d）至停止給藥14?d。所有雞蛋編號(hào)原則為組別/日期。

1.2.4?樣品檢測(cè)。

采用阿莫西林殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，對(duì)采集的雞蛋樣品進(jìn)行藥物含量檢測(cè)。

1.2.4.1?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

根據(jù)試劑盒說(shuō)明，取試劑盒中阿莫西林各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值，以百分吸光率[（B/B0）×100%]（B值為標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0?μg/kg?標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值）為縱坐標(biāo)，以不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并推導(dǎo)出回歸方程，進(jìn)行相關(guān)回歸分析。

1.2.4.2?試劑盒加標(biāo)回收率試驗(yàn)。

取一定體積的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加至空白雞蛋樣品，使樣品的藥物含量分別為100、20、10?μg/kg，每個(gè)濃度的樣品做2次平行。

阿莫西林雞蛋樣品前處理方法如下：稱(chēng)?。?.0±0.05）g均質(zhì)后的雞蛋樣本至10?mL聚乙烯離心管中加入2?mL去離子水，用渦旋儀渦動(dòng)1?min，3?000?r/min室溫（20～25?℃）下離心5?min移取200?μL上清液至1.5?mL聚乙烯離心管中，再加入200?μL復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng)1?min，混勻，取50?μL用于分析。

1.2.4.3?試劑盒精確度試驗(yàn)。

取一定體積的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加至空白雞蛋樣品，使樣品的藥物含量分別為100、20、10?μg/kg，按試劑盒提供的方法樣品預(yù)處理后進(jìn)行檢測(cè)。同一天內(nèi)每個(gè)濃度重復(fù)5個(gè)樣品，取平均值，計(jì)算日內(nèi)變異系數(shù)。

1.2.4.4?阿莫西林在雞蛋中的含量檢測(cè)。

檢測(cè)前，首先將所有的試劑必須恢復(fù)到室溫23～27?℃，任何不用的試劑須立即置于4?℃下保存。將采集的樣品按照步驟“1.2.4.2”相應(yīng)的方法進(jìn)行前處理。處理后，按照試劑盒的方法進(jìn)行檢測(cè)。

預(yù)試驗(yàn)：停止給藥后1、3、7?d，每組各取2個(gè)樣品，進(jìn)行檢測(cè)，考察樣品濃度是否在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，若樣品濃度過(guò)高，需對(duì)樣品進(jìn)行一定的稀釋后，再次進(jìn)行檢測(cè)。

正式試驗(yàn)：每次檢測(cè)時(shí)，均需制備2條標(biāo)準(zhǔn)曲線，保證此次檢測(cè)結(jié)果的可靠性。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各組均檢測(cè)10個(gè)樣品，保證結(jié)果的真實(shí)性。

1.3?數(shù)據(jù)分析

通過(guò)試劑盒專(zhuān)用的數(shù)據(jù)處理軟件Ridawin，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得到對(duì)應(yīng)的藥物濃度值，藥物濃度以μg/kg為單位。

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的雞蛋中的藥物濃度均10枚雞蛋的平均值（）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，以此考察阿莫西林在雞蛋中的殘留消除。參考沈建忠等在2000年報(bào)道的國(guó)內(nèi)常用實(shí)測(cè)濃度判斷法，該方法是以所有被檢測(cè)動(dòng)物的各組織中藥物殘留量均低于MRLs所需要的時(shí)間作為休藥期[7]。同時(shí)，使用WT1.4軟件按95%置信區(qū)間計(jì)算阿莫西林在雞蛋的休藥期（WDT）。

2?結(jié)果與分析

2.1?樣品采集

按照給藥方法對(duì)雞只進(jìn)行給藥，在第1天給藥后進(jìn)行雞蛋采集，每組每日均采集15枚雞蛋，剩余雞蛋棄去。試驗(yàn)期間共采集19?d，共收集855枚雞蛋。

2.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取試劑盒中的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)物（0、1.5、4.5、13.5、40.5、121.5?μg/kg）進(jìn)行ELISA測(cè)定，以百分吸光率為縱坐標(biāo)，以不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，可知阿莫西林酶聯(lián)免疫試劑盒的線性關(guān)系良好（圖1）。

2.3?加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取一定體積的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加至空白雞蛋樣品，使樣品的藥物含量分別為100、20、10?μg/kg，每個(gè)濃度做2個(gè)平行。樣品前處理后檢測(cè)，結(jié)果表明阿莫西林100、20、10?μg/kg的回收率分別為81.1%、852%和123.0%，與試劑盒說(shuō)明書(shū)基本保持一致。

2.4?精確度試驗(yàn)

取一定體積的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加至空白雞蛋樣品，使樣品的藥物含量分別為100、20、10?μg/kg，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)5次，計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，阿莫西林試劑盒的變異系數(shù)為4.02%，變異系數(shù)小于10%，表明重復(fù)性良好。

2.5?樣品的檢測(cè)

2.5.1?預(yù)試驗(yàn)結(jié)果。

停藥后1、3、7?d的雞蛋樣品，每組各取2個(gè)樣品，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度為121.5?μg/kg，前處理過(guò)程樣品被稀釋6倍，則最高可檢測(cè)濃度為729?μg/kg。由上述檢測(cè)最高濃度約387?μg/kg，未超過(guò)標(biāo)曲最高線。因此，樣品不需要稀釋?zhuān)梢灾苯舆M(jìn)行檢測(cè)。

2.5.2?正式檢測(cè)。

每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)10個(gè)樣品，空白對(duì)照組為未給藥的空白雞蛋，檢測(cè)結(jié)果均小于10?μg/kg，2個(gè)給藥組的具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，2組在給藥期間藥物濃度不斷升高，且均在停藥后第1天藥物濃度達(dá)到最高值，此后逐步降低;停藥后第9天后藥物濃度均低于10??μg/kg。

2.6?休藥期的計(jì)算

2.6.1?實(shí)測(cè)濃度判斷法。

在中國(guó)和歐美國(guó)家，雞蛋中阿莫西林均無(wú)最低殘留限量（MRLs），僅日本公布的雞蛋中阿莫西林的最低殘留限量（MRLs）為10?μg/kg。由檢測(cè)結(jié)果可知，2個(gè)廠家的阿莫西林均在停藥后第9天檢測(cè)濃度低于10?μg/kg，按照實(shí)測(cè)濃度法可判定其休藥期為停藥后第9天。

2.6.2?WT?1.4軟件計(jì)算法。

采用WT?1.4軟件按95%置信區(qū)間計(jì)算阿莫西林在雞蛋的休藥期（WDT）。阿莫西林在雞蛋中的休藥期數(shù)據(jù)擬合圖見(jiàn)圖2、3。由圖2、3可知，Ⅰ組和Ⅱ組阿莫西林在雞蛋中的休藥期分別為12.74和12.72?d。

3?討論與結(jié)論

在中國(guó)和歐美國(guó)家，雞蛋中阿莫西林均無(wú)最低殘留限量（MRLs），僅日本公布的雞蛋中阿莫西林的最低殘留限量（MRLs）為10?μg/kg。該試驗(yàn)依據(jù)阿莫西林的給藥說(shuō)明書(shū)（30%），按100?mg/kg體重劑量口服給藥，一日2次，連用5?d。結(jié)果表明，2個(gè)廠家的阿莫西林均在停藥后第1天，雞蛋中藥物殘留量達(dá)到最高值;藥物殘留量在停藥后迅速降低，且均在停藥后第9天檢測(cè)濃度低于MRLs（10?μg/kg），2個(gè)廠家的阿莫西林藥物代謝消除曲線基本重合。

休藥期（WDT）是指從停止給藥到允許動(dòng)物屠宰或其產(chǎn)品上市的間隔時(shí)間。WDT可簡(jiǎn)單理解為從停止給藥到保證組織中殘留濃度降至低于安全濃度MRLs需要的時(shí)間。WDT的計(jì)算方法主要有實(shí)測(cè)濃度判斷法[7]、回歸法[8]、群體藥動(dòng)學(xué)方法[9]和非參數(shù)方法[10]。

沈建忠等[7]報(bào)道的國(guó)內(nèi)常用實(shí)測(cè)濃度判斷法，是以所有被檢測(cè)動(dòng)物各組織的藥物殘留均低于MRLs所需時(shí)間為休藥期。根據(jù)國(guó)內(nèi)實(shí)測(cè)濃度判斷法，可初步判定阿莫西林在雞蛋的休藥期為停藥后第9天。

美國(guó)FDA規(guī)定使用回歸法測(cè)定WTD。該方法是將濃度作對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后與時(shí)間做線性回歸，將回歸曲線的95%可信限的上限降至MRLs所需要時(shí)間為休藥期[8]。故一般經(jīng)常使用休藥期軟件WT?1.4，采用回歸法計(jì)算得出的休藥期。采用WT?1.4軟件按95%置信區(qū)間計(jì)算阿莫西林在雞蛋的休藥期（WDT），2個(gè)廠家的阿莫西林再雞蛋中的休藥期分別為12.74和12.72?d。

Liu等[11]2017年研究表明，在25和50?mg/kg的劑量下，全蛋中所有殘留物的理論消除時(shí)間分別為8.00和911?d。

Xie等[12]2013年研究表明，50?mg/kg劑量下在全蛋中在停藥后第10.5天，徹底檢測(cè)不到阿莫西林。與該試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果休藥期（12.74?d）基本保存一致。該試驗(yàn)中阿莫西林在雞蛋中的代謝曲線與文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道基本一致，均在停藥后第1天左右達(dá)到藥物濃度最高值。孫禮瑞等[13]在2015年研究報(bào)道的阿莫西林在雞組織中的殘留消除規(guī)律，結(jié)果是休藥后第5天阿莫西林殘留量低于最高殘留限量（50?μg/kg）;該試驗(yàn)中雞蛋樣品在停藥后第5天藥物殘留量為40.22?μg/kg，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外關(guān)于阿莫西林在雞蛋中的殘留研究極少，且多采用高效液相和質(zhì)譜等的檢測(cè)方法，但其前處理方法復(fù)雜，包含液液提取、固相萃取凈化和衍生化等多步提取。該研究采用酶聯(lián)免疫試劑盒，快速檢測(cè)雞蛋中的阿莫西林殘留量，通過(guò)回收率和靈敏度驗(yàn)證，證明方法的科學(xué)性和可行性。開(kāi)展2個(gè)不同廠家的阿莫西林在蛋雞中的殘留消除試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的消除曲線基本一致，且2個(gè)廠家的阿莫西林，在雞蛋中的殘留情況基本無(wú)差異。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋雞在使用阿莫西林后，其在雞蛋中休藥期較長(zhǎng)（12.74?d），且不同廠家的阿莫西林在雞蛋中的休藥期無(wú)差異，為臨床提供相關(guān)的科學(xué)數(shù)據(jù)和快速檢測(cè)的方法，防止獸醫(yī)臨床上的不合理使用，保障動(dòng)物源性食品安全。

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