貴州白山羊脂聯(lián)素基因（ADIPOQ）序列和表達(dá)分析

安清明，吳震洋，孟金柱，趙園園，樊軍德，田秀珍，王 星

（1.銅仁學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.華珍牧業(yè)有限公司，貴州 銅仁 554300）

貴州白山羊是中國著名的地方山羊品種，主要分布在黔東南、黔東北等地區(qū)，存欄量100多萬只，是發(fā)展貴州畜牧業(yè)的重要種質(zhì)資源。脂聯(lián)素（adiponectin，ADIPOQ）是脂肪細(xì)胞分泌的唯一與脂肪含量負(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子，相關(guān)文獻(xiàn)表明，ADIPOQ基因在脂肪代謝中起重要的調(diào)控作用[1]，脂聯(lián)素基因由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，其主要編碼的脂聯(lián)素蛋白由信號肽、可變區(qū)、N-膠原蛋白三螺旋區(qū)域和C-球狀區(qū)域構(gòu)成，能夠通過結(jié)合蛋白直接參與調(diào)解脂肪酸氧化和糖類攝取過程[2]。目前，研究發(fā)現(xiàn)ADIPOQ基因與人體的肥胖、胰島素耐受性和動脈粥樣硬化等疾病相關(guān)[3]，但在家畜動物研究中發(fā)現(xiàn)ADIPOQ基因遺傳變異對家畜動物的生產(chǎn)性狀具有一定的影響，如ADIPOQ基因變異可以影響豬的胴體性狀[4]，影響牛的眼肌面積、背標(biāo)厚度[5]，影響綿羊的生長速度和胴體性狀等[6]。但在山羊中該基因的研究報道較少，僅發(fā)現(xiàn)954G/A變異可以影響山羊產(chǎn)羔數(shù)[7]。因此，本研究擬通過ADIPOQ基因的序列和表達(dá)分析，進(jìn)一步增進(jìn)貴州白山羊的遺傳多樣性和發(fā)育情況的了解，以期對貴州白山羊的合理利用提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的貴州白山羊血樣及組織樣均采自貴州省銅仁市德江縣高山鎮(zhèn)。采集的新鮮血樣和組織樣分別于-20℃和-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗儀器及試劑

Bio-Rad PCR儀，Bio-Rad 凝膠成像儀，高速低溫離心機，水平電泳儀，ABI實時熒光定量PCR儀，DNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量試劑盒，PCR預(yù)混酶等。

1.3 PCR引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI中綿羊ADIPOQ基因序列（NC_019458.2），利用Primer 5.0 設(shè)計特異性引物：F：GGATTCTGAACATCATTCATTC，R:CAGATGAGTTGGTGGGAGAC，用于ADIPOQ基因序列分析；設(shè)計特異性引物F：TACAAGAACGACAAGGCCCT，R：ACTTGGTCACCCTTCTCCAG用于組織特異性表達(dá)分析，其中熒光定量分析以GAPDH基因為內(nèi)參基因，特異性引物為F: CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA，R:GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTT，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 ADIPOQ基因部分序列PCR擴增及測定

PCR反應(yīng)體系：DNA樣品1μl，Taq PCR預(yù)混酶11 μl，10 mmol·L-1上下游混合引物1 μl，加ddH2O至20μl。

PCR擴增程序：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，34個循環(huán)，延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測無特異性條帶后送生工生物工程（上海）測序。

1.5 遺傳多樣性數(shù)據(jù)處理

用MEGA5.0軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析比對，通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找相關(guān)物種序列，建立數(shù)據(jù)庫，用Lasergene7.0軟件對相關(guān)物種序列進(jìn)行處理并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 ADIPOQ基因?qū)崟r熒光定量分析

采用Trizol法提取貴州白山羊各組織（心、肝、脾、肺和腎）總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照說RT-qPCR說明書指導(dǎo)配置反應(yīng)體系并設(shè)定反應(yīng)程序。采用RT-qPCR方法分析ADIPOQ基因在白山羊心、肝、脾、肺和腎中的表達(dá)特異性。熒光定量試驗設(shè)計3個重復(fù)，采用2-△△CT方法將數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，計算相對表達(dá)量，最后利用Minitab16.0進(jìn)行顯著性差異分析。

圖1 貴州白山羊ADIPOQ基因測序結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果分析

已知引物擴增序列為455 bp，將檢測的DNA測序經(jīng)Chromas軟件進(jìn)行結(jié)果分析（圖1），結(jié)果顯示所用貴州白山羊樣品測定序列波峰信號單一，無其他雜亂信號干擾，預(yù)示測序結(jié)果準(zhǔn)確，可用于后續(xù)的序列分析。

2.2 貴州白山羊ADIPOQ基因差異性對比結(jié)果分析

利用MEGA5.0程序?qū)Ρ狙芯恐袦y得的貴州白山羊ADIPOQ基因序列與An等[6]發(fā)現(xiàn)的綿羊等位基因A和B進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)貴州白山羊與綿羊等位基因A和B共有8處核苷酸變異，分別為c.26 C/G、c.161 C/T、c.190 C/A、c.196 C/T、c.226 C/T、c.331 C/A、c.407 C/T和c.418 G/A變異，比對結(jié)果見圖2。

2.3 貴州白山羊ADIPOQ基因群體間遺傳特征

從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索其它6個不同物種ADIPOQ基因與本試驗檢測得到的貴州白山羊核苷酸序列根據(jù)領(lǐng)位相連法（Neighbor-joining，NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果表明，貴州白山羊與綿羊遺傳距離最近，與牛和牦牛次之，而與豬、人類遺傳距離較遠(yuǎn)，這一結(jié)果與這些物種在生物學(xué)上進(jìn)化分類一致。

圖2 貴州白山羊與綿羊ADIPOQ基因核苷酸序列比對結(jié)果

圖3 不同物種ADIPOQ基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹

2.4 貴州白山羊ADIPOQ基因在不同組織中的表達(dá)分析

利用實時熒光定量PCR對貴州白山羊心、肝、脾、肺和腎組織中的ADIPOQ基因編碼mRNA的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，由圖4可知，ADIPOQ基因在肺組織中的表達(dá)量最高，其次是脾、心和肝，在腎中的表達(dá)量最低。

圖4 貴州白山羊ADIPOQ基因編碼mRNA表達(dá)分析

3 討論

通過測序結(jié)果比對分析，雖然在貴州白山羊樣本里沒有發(fā)現(xiàn)核苷酸變異，但與綿羊不同等位基因比對發(fā)現(xiàn)8處核苷酸變異位點，說明貴州白山羊與綿羊物種之間存在的種間差異，也可能是貴州白山羊樣品來源群體經(jīng)過了世代選擇，使得白山羊群體間核苷酸變異減少，但該結(jié)果也表明，白山羊與綿羊之間仍具有核苷酸變異，且這用變異差距可能會影響到貴州白山羊的生產(chǎn)性狀，已有研究表明ADIPOQ基因核苷酸變異可以影響豬、牛和綿羊的生產(chǎn)性狀[4-7]。本研究基于遺傳距離聚類算法構(gòu)建了貴州白山羊群體的聚類圖，通過與不同物種之間的聚類分析，推測了物種間的適應(yīng)性進(jìn)化，研究發(fā)現(xiàn)，貴州白山羊與綿羊間的遺傳距離最小，牛屬次之，這與物種的進(jìn)化關(guān)系一致，且它們均屬于偶蹄目家畜，與其它物種間的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。

對貴州白山羊內(nèi)臟器官進(jìn)行ADIPOQ基因編碼mRNA表達(dá)量檢測，結(jié)果表明在所檢測器官中均有表達(dá)，但在肺臟中表達(dá)量最高，在腎臟中表達(dá)量最低，這與李雪梅等研究結(jié)果存在差異[8]，但與陳宇光等研究結(jié)果相似，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)ADIOQ基因mRNA在腎臟組織中的表達(dá)量最低[9]。本研究對貴州白山羊ADIPOQ基因序列和蛋白進(jìn)行了分析，分析結(jié)果有助于對ADPOQ基因序列變異和功能進(jìn)行深入研究，也為進(jìn)一步研究ADIPOQ基因?qū)F州白山羊生長性能和脂肪累積過程中的功能奠定了遺傳信息基礎(chǔ)。