胞外電子傳遞機制及其環(huán)境效應研究進展

金 輝, 王紅武

(同濟大學環(huán)境科學與工程學院，上海 200092)

引 言

微生物能通過呼吸作用氧化有機物為自身供給能量，呼吸作用對于微生物的自身生長以及環(huán)境中物質的循環(huán)都有著十分重要的意義。經(jīng)典呼吸鏈理論認為細胞膜是生物電子傳遞、能量代謝的主要場所。近年來，關于胞外電子傳遞的研究將經(jīng)典呼吸鏈從細胞內(nèi)延伸到了細胞外，基于此類呼吸鏈的能量代謝方式即為胞外呼吸[1]。胞外呼吸是指微生物在厭氧條件下在胞內(nèi)徹底氧化有機物并釋放電子，經(jīng)胞內(nèi)呼吸鏈傳遞到胞外電子受體使其還原并產(chǎn)生能量維持微生物自身生長的過程[2]。可以進行胞外呼吸的微生物被稱為胞外呼吸菌，其廣泛分布于土壤、河流、海底沉積物中，可分為異化金屬還原菌、腐殖質還原菌和產(chǎn)電菌3大類，多數(shù)為革蘭氏陰性菌，極少數(shù)為革蘭氏陽性菌[3]。胞外電子傳遞最早是在20世紀80年代由Lovely等人提出的[4]，此后胞外電子傳遞受到了眾多科研工作者的關注，其作為一種新型的細胞呼吸方式，在廢水處理、環(huán)境修復、能量回收方面都有著較大的應用前景，因此對其傳遞機理、影響因素和應用前景的研究具有重要現(xiàn)實意義[5-6]。

1 胞外電子傳遞機理

微生物胞外電子傳遞主要包括兩個過程。第一個過程是電子產(chǎn)生后從內(nèi)膜經(jīng)過周質傳遞到外膜，底物在微生物作用下發(fā)生氧化磷酸化，失去的電子通過胞內(nèi)的NADH脫氫酶、輔酶Q、泛醌等傳遞至細胞內(nèi)膜，再通過一系列細胞色素蛋白(Cytochrome，Cyt)或其它功能蛋白傳遞至細胞外膜[7]。細胞色素蛋白是一類以血紅素(heme)為輔基的電子傳遞蛋白的總稱，幾乎存在于所有的生物體內(nèi)。根據(jù)吸收光譜的不同，細胞色素可以分為a、b、c三類。第二個過程是電子從細胞外膜傳遞到最終電子受體，主要有直接接觸傳遞，納米導線傳遞機制、電子穿梭機制傳遞和應電運動四種傳遞機制[8]。

1.1 電子由內(nèi)膜傳遞到外膜

不同產(chǎn)電菌將電子從內(nèi)膜傳遞到外膜的方式不同，但細胞色素蛋白尤其是細胞色素c都起著舉足輕重的作用。希瓦氏菌(ShewanellaoneidensisMR-1)和地桿菌(Geobactersulfurreducens)是目前對胞外電子傳遞機制研究最完善的兩種胞外呼吸菌。

S.oneidensisMR-1的電子傳遞機理如圖1所示，其細胞膜及周質空間中分布著由多種細胞色素蛋白所構建的電子傳遞網(wǎng)絡[9-10]。CymA氧化位于內(nèi)膜上的醌類中間體，并將釋放的電子傳遞至位于周質中的細胞色素c。位于外膜上的MtrA、MtrB、MtrC和MtrC的同族蛋白OmcA形成跨外膜蛋白復合物Mtr途徑，將電子從周質蛋白傳遞到細菌外膜表面。最后，由外膜細胞色素MtrC/OmcA完成對胞外電子受體的還原，即直接將電子傳遞到胞外電子受體上[11]。在這個過程中，CymA起著重要的樞紐作用，SirC和SirD組成的SirCD復合體可作為其替代物[12]。同樣的，MtrABC也存在相應的同源物MtrFDE，這兩個Mtr同系物模塊具有相似的功能。其中，MtrA/D位于周質蛋白中，不能與外膜蛋白直接接觸，MtrB/E起到了連接周質和外膜的作用，MtrC/F和OmcA/SirCD按1∶2的比例形成蛋白復合體，可與胞外電子受體直接接觸并傳遞電子[13]。

圖1 希瓦氏菌(S.oneidensis MR-1)胞外電子傳遞示意圖Fig.1 Schematic diagram of S.oneidensis MR-1 extracellular electron transfer

Geobacter的胞外電子傳遞模式與S.oneidensisMR-1類似，但Geobacter內(nèi)各菌株內(nèi)具有更多的細胞色素c ，且種間差異較大，因而其傳遞模式更為復雜。G.sulfurreducens位于內(nèi)膜表面與細胞質相連的MacA對于將電子傳遞至外膜蛋白至關重要，它可以從醌池中獲得電子[14]，并還原位于周質中的三亞鐵血紅素PpcA[15]，并將電子傳遞至外膜蛋白的OMCs(包括OmcB、OmcE、OmcS及OmcZ)[16]。與S.oneidensisMR-1不同的是G.sulfurreducens必須通過導電菌毛將電子傳遞給胞外電子受體。S.oneidensisMR-1的Mtr金屬還原通道中的 MtrABC 蛋白復合體與G.sulfurreducens的孔蛋白-色素蛋白復合體沒有同源性，說明它們相似的跨膜電子傳遞功能是通過獨立進化而來的[17]。

1.2 電子從外膜傳遞到胞外電子受體

胞外呼吸的最終電子受體多為固體或大分子物質，無法進入細胞膜，因此電子需要從細胞膜傳遞到最終電子受體，由于這個過程發(fā)生在細胞外，因此目前的研究多集中于此，其機理也較為清晰。電子由外膜到最終電子受體主要有以下4種機制：直接接觸機制、納米導線機制、電子穿梭機制以及應電運動機制(如圖2)[8,17]。

圖2 4種胞外電子傳遞機制示意圖Fig.2 Schematic diagram of four kinds of extracellular electron transfer mechanism

直接接觸傳遞是指胞外呼吸菌與電子受體直接接觸，通過分布細胞膜外側的Cyt c將電子直接傳遞到胞外電子受體表面[18]，直接接觸傳遞是最直接的電子傳遞方式，但是該途徑需要胞外呼吸菌緊靠胞外電子受體，限制了其應用且電子傳遞效率受到細菌濃度以及接觸面積的影響[19-20]。

納米導線最早是在2005年由Reguera等[21]提出的，他們發(fā)現(xiàn)胞外呼吸菌G.sulfurreducensDL1的菌毛具有導電性，并把這種生長在細胞周圍的類似纖毛且具有導電性能的聚合蛋白微絲命名為“微生物納米導線”。在電子傳遞過程中，納米導線如同電子導管一樣，將細胞膜與電子受體連接起來。由于納米導線的存在，胞外呼吸菌可以在不接觸受體的情況下，實現(xiàn)電子遠距離轉移，并且大大提高電子傳遞效率[14,22]。

微生物可以利用外源介體(如環(huán)境中存在的腐殖質、植物根系分泌物等)或內(nèi)生介體(自身分泌的代謝產(chǎn)物，如核黃素等)，將電子轉移至電子受體，這種通過中介體進行胞外電子傳遞的方式即為電子穿梭機制，作為中介體的外源或內(nèi)生介體叫做電子穿梭體(electron shuttle，ES),也稱為氧化還原介體(redox mediate，RM)[23]。電子穿梭體是一種特殊的電子載體，可以可逆地參與氧化還原反應。電子穿梭體可以穿過細胞膜，在細胞內(nèi)被還原并將電子傳遞到胞外電子受體，在受體表面被氧化，如此循環(huán)往復，實現(xiàn)電子的跨膜轉移。

應電運動機制是指某些胞外呼吸菌可以將產(chǎn)生的電子儲存在細胞膜表面，然后利用鞭毛運動撞擊受體表面，在撞擊瞬間釋放電子，完成電子轉移。在接觸釋放電子后，從胞外電子受體表面脫離，參與下一個循環(huán)[24]。

2 胞外電子傳遞的影響因素

胞外電子傳遞發(fā)展?jié)摿茫S著對其傳遞機理研究的不斷深入，人們開始關注影響胞外電子傳遞效率的因素，以及可以促進電子傳遞的措施。深入研究胞外電子傳遞機理以及促進措施對胞外電子傳遞在各個領域的應用有著十分重要的意義。

2.1 細胞色素c對胞外電子傳遞的影響

細胞色素c對胞外電子傳遞起到至關重要的作用。細胞色素c通常含有多個血紅素(heme)，電子可以在相鄰血紅素的鐵原子之間進行轉移，使得細胞色素c可以傳遞電子[25]。理論計算發(fā)現(xiàn)，細胞色素c中血紅素的距離和排列方式會影響電子傳遞的能力和效率[26]，因此，細胞色素c對電子的傳遞能力與其分子結構密切相關。韓蕊[9]對S.oneidensisMR-1野生型和各種突變體對水鐵礦的還原及生物礦化作用進行了研究，結果表明MR-1主要通過胞外電子傳遞將水鐵礦還原呈Fe2+，并且敲除MtrA、CymA等關鍵系胞色素c后，MR-1的電子傳輸能力大幅降低，對水鐵礦的還原速率和轉化程度也降低，說明MtrA、CymA是S.oneidensisMR-1胞外電子傳遞鏈的重要影響因素。丁德武[27]通過構建基因組尺度的S.oneidensisMR-1細胞色素c網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)細胞色素c網(wǎng)絡的獨特結構可能衍生出S.oneidensisMR-1產(chǎn)生電力的能力，并且可以從該細胞色素c網(wǎng)絡中識別潛在的EET途徑。Li Hui等人[28]將含氧官能團引入微生物燃料電池(Microbial fuel cells，MFCs)陽極后發(fā)現(xiàn)該MFCs的最大電荷密度增加了27.7%，陽極電阻則降低了21.8%，研究表明，含氧基團的存在并沒有改變MFCs中的微生物群落，但其可以進行胞外電子傳遞的電化學活性菌(Electrochemically Active Bacteria，EAB)細胞表面的細胞色素c比對照組增加了4倍，這說明細胞色素c含量的增加可以增強EAB和電極之間的胞外電子轉移。

2.2 解偶聯(lián)劑對胞外電子傳遞的影響

胞外電子傳遞過程十分復雜，底物在氧化的過程中會在細胞質膜兩側產(chǎn)生質子推動力(proton motive force，PMF)，為ADP磷酸化形成ATP提供能量。底物的氧化會生成大量電子和質子，并在膜外側累積。在一定濃度范圍，利用解偶聯(lián)劑分離底物氧化過程和ATP合成過程，膜外側質子的累積及產(chǎn)物抑制被破壞，包括S.oneidensisMR-1在內(nèi)的六種純種微生物胞外電子傳遞過程得到促進[29]。

虞盛松[30]通過考察不同濃度的解偶聯(lián)劑3,3’,4’,5-四氯水楊酰苯胺(tetrachlorosalicylanilide, TCS)對Shewanella胞外電子傳遞的調控發(fā)現(xiàn)低濃度(50 g/L)的TCS可以在促進MR-1對乳酸的消耗同時提高Shewanella的產(chǎn)電能力；而高濃度(400 g/L)的TCS會通過降低ATP合成酶的活性來抑制Shewanella的代謝和產(chǎn)電。這些結果表明，適當添加解偶聯(lián)劑是一種簡便的胞外電子傳遞調控手段。

2.3 鐵氧化物對胞外電子傳遞的影響

鐵氧化物表面與微生物胞外電子傳遞鏈上的細胞色素c之間的相互作用決定了鐵氧化物-微生物界面電子轉移的效率。理論計算結果表明胞外電子傳遞過程中不同蛋白之間的電子傳遞速率遠遠大于外膜蛋白和鐵礦物界面的電子傳遞速率，因此微生物胞外電子傳遞的決速步驟是外膜蛋白與鐵礦物表面之間的電子轉移過程[31]。磁鐵礦能夠促進鐵還原微生物的胞外電子傳遞，在水田沉積物中加入磁鐵礦能在Geobacter富足的情況下加速電子傳遞到電極上的過程[32]。也有研究發(fā)現(xiàn)，磁鐵礦能夠取代Geobacter胞外電子傳遞過程中菌毛的作用，促進地桿菌的長距離電子傳遞[33]。納米磁鐵礦能像細胞色素c一樣附著在Geobacter的菌毛上，從而促進胞外電子傳遞，且可以代替OmcS完成胞外電子傳遞[34]。近期天然赤鐵礦也被驗證能夠有效參與并促進微生物胞外電子傳遞[35]。

2.4 電子穿梭體對胞外電子傳遞的影響

在間接胞外電子傳遞過程中，微生物可以依靠自身分泌的內(nèi)生介體或外界介體作為電子穿梭體，完成電子的跨膜傳遞。外加電子穿梭體(如腐殖質、黃素等)的存在對胞外電子傳遞具有促進作用。在ShewanelladecolorationisS12和AeromonashydrophilaHS01還原針鐵礦(α-FeOOH)的過程中，添加AQC可使針鐵礦的還原速率提高3～4倍的[36-37]；在G.sulfurreducens還原水鐵礦的過程中，添加溶解態(tài)腐殖質可使水鐵礦還原速率提升6倍[38]；在利用醌類物質2-羥基-1，4-萘酯LQ還原Se(Ⅳ)、Te(Ⅳ)的過程中，腐殖質類物質的加入能夠有效增強二者的還原效果[39]；在Bacillussp.BT1還原Cr(Ⅵ) 的過程中，AQS的存在可以提高Cr(Ⅵ)的還原效率[40]；在利用S.oneidensisMR-1還原Fe(Ⅲ)氧化物的研究中，加入10μM/L的黃素類物質，F(xiàn)e(Ⅲ)氧化物的還原速率可提供18倍[23]。

3 胞外電子傳遞的應用

胞外電子傳遞由于其電子受體的存在于細胞外的這一特殊性，因而在污水處理、污染物轉化降解和生物能源的清潔生產(chǎn)中有著廣闊的應用前景。

3.1 基于微生物燃料電池的應用

微生物燃料電池(MFCs)，是以微生物為催化劑將可生物利用有機質中化學能直接轉化為電能的燃料電池系統(tǒng)。MFCs以胞外電子傳遞鏈為基礎，利用胞外電極接收胞外呼吸菌產(chǎn)生的電子，轉化為電能。在MFCs中，微生物在陽極催化氧化有機污染物并產(chǎn)生質子和電子，質子通過基質和質子交換膜(Proton exchange membrane ，PEM)傳遞到陰極，與氧氣和電子結合生成水；微生物通過呼吸作用產(chǎn)生的電子首先通過胞內(nèi)電子傳遞鏈傳遞到細胞膜，然后通過納米導線或電子穿梭體等直接或間接的方式傳遞到陽極表面再通過外電路傳遞到陰極，在陰極與電子受體發(fā)生還原反應，完成整個氧化還原反應，同時電子不斷流過外電路而產(chǎn)生電能[41]MFC系統(tǒng)組成示意圖如圖3所示。自1991年MFCs第一次被用于處理污水，微生物燃料電池電池掀起了胞外電子傳遞的應用熱潮，也是目前胞外電子傳遞研究最多，應用最廣泛的領域[42]。

圖3 MFC示意圖Fig.3 Schematic diagram of microbial fuel cell

目前MFCs在微生物產(chǎn)電，易降解有機物、難降解有機物降解，生物脫氮、生物脫硫等領域有較多研究[41,43～47]。

廢水中含有大量的有機物，這些物質可以作為碳源和電子供體被陽極微生物利用，在去除污染物的同時還可以進行能量回收。Li[48]利用單室空氣陰極MFC系統(tǒng)處理某食堂廢水，研究表明在進水COD為2 700±20mg/L時，MFC的最大功率密度可達5.6W/m3，平均輸出電壓為0.51V，并且COD去除率可高達90.3%。Guo[49]利用雙室MFC處理煉油廢水時發(fā)現(xiàn)COD和含油量分別為450±50mg/L和50±5mg/L時，可分別去除64±4%的COD和84±3的含油量，此時MFC的最大功率密度為0.33 W/m3。Miran[45]處理某含銅量為20mg/L的廢水時發(fā)現(xiàn)，雙室MFC對Cu2+的還原效率可超過98%，同時TOC的去除率也可超過90%。

3.2 基于污染物降解的應用

胞外電子傳遞也可應用于環(huán)境修復，在降解有機污染物、氧化還原有毒有害重金屬污染物等方面起到了重要作用。微生物利用胞外電子傳遞降解污染物主要通過兩種機理：一是以有機污染物為電子供體，降解有機物；二是以污染物為電子受體，將有毒有害的的重金屬污染物轉化為低毒或無毒狀態(tài)[5]。

人類活動產(chǎn)生了大量有機污染物，有機物電子供體的異化作用會把 O2作為電子受體而迅速消耗掉，從而形成厭氧環(huán)境，為 Fe(Ⅲ)氧化物作為電子受體參與有機物的氧化提供了主要場所，使得微生物通過胞外電子傳遞降解有機物成為可能。少數(shù)地桿菌可以在還原Fe(Ⅲ)氧化物的同時氧化芳香族化合物并降解一些微生物無法直接利用的共存污染物，這對修復芳烴污染的土壤有重大意義[50]。

以金屬為最終電子受體的金屬還原菌，可以還原污水中的有價金屬污染物，將有毒金屬污染物轉化為無毒或低毒物質。此外對于Cr(Ⅵ)，Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)，Tc(Ⅶ)和U(Ⅵ)等以溶解態(tài)存在金屬元素，以及Cr(Ⅲ)，Se(0)，Tc(Ⅳ)和U(Ⅵ)等不溶態(tài)存在的金屬元素也可以利用金屬還原菌進行修復[51]。如脫硫弧菌(Desulfovibriospp.)可以以H2為電子供體利用細胞色素c還原Cr(Ⅵ)[52]。在生物浸出方面，氧化亞硫桿菌在低品位的銅礦、金礦、鈾礦等領域取得了良好的浸出效果[53]。生物浸出同樣是利用胞外電子傳遞，將非溶解態(tài)有價金屬轉變?yōu)槿芙鈶B(tài)離子，并加以回收，在礦產(chǎn)資源的回用中應用廣泛。除了金屬離子污染物，鐵還原菌可以降解水中的有機污染物[54]。對于一些難降解有機污染物，如石油烴、多氯聯(lián)苯和硝基苯等污染物的去除效果也較好[55]。在生物脫鹽領域，以胞外電子傳遞為基礎的微生物脫鹽電池(Microbial desalination cell，MDC)，能夠利用產(chǎn)電菌去除溶液中的部分陰、陽離子，從而起到較好的脫鹽效果[56]。

微生物胞外電子傳遞可以產(chǎn)生含胞外電子受體的納米材料，對Fe(Ⅲ)，Pd(Ⅱ)，Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)等的胞外還原可以形成含F(xiàn)e(Ⅱ)，Pd(0)，Se(0)等的納米材料。這些納米材料在催化，修復環(huán)境等方面都有著重要作用[4,57]。

4 結語與展望

胞外呼吸豐富了微生物代謝的多樣性，在微生物燃料電池、污水處理、環(huán)境修復和納米材料合成等環(huán)境領域有著良好的應用前景，因此，微生物胞外電子傳遞的研究將受到持續(xù)的關注。目前主要針對兩種產(chǎn)電菌(S.oneidensis MR-1和G.sulfurreducens)開展了電子從胞內(nèi)傳遞到細胞外膜的研究，對其他產(chǎn)電菌的研究很少；而隨著部分微生物胞外電子傳遞過程中至關重要的細胞色素蛋白得到確定，電子傳遞途徑逐漸清晰；人們已發(fā)現(xiàn)通過調控電子從外膜到胞外電子受體的過程可以影響電子傳遞的效率。但是，目前胞外電子傳遞的研究還有很大的局限性，大多數(shù)的研究針對單一菌種，如集中在S.oneidensis和G.sulfurreducens這兩種產(chǎn)電菌上，亟待對其他菌種以及混合菌群開展研究，且胞外電子傳遞的分子學機制需要進一步完善。此外，在研究傳遞機理的同時，也亟需開展胞外電子傳遞的影響因素以及促進措施的研究，以提高產(chǎn)電效率及處理污染物的效果等?！?/p>