利用單分子實時測序技術(shù)確定抗旱轉(zhuǎn)基因玉米染色體插入位置（2020.4.12 萊肯生物）

安全評價是轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的必要條件，鑒定外源片段在基因組的插入位置其中重要的環(huán)節(jié)。熱不對稱交錯PCR（Tail-PCR）和染色體步移（Genome Walking）技術(shù)是檢測基因組側(cè)翼序列的常用方法，而第二代測序技術(shù)（NGS）的快速發(fā)展為此提供了低成本高通量的鑒定方案。然而，基于PCR的方法和NGS技術(shù)難以識別復(fù)雜基因組序列的所有轉(zhuǎn)基因事件插入位點(diǎn)、側(cè)翼序列以及外源片段插入后的修飾或重排。

中國農(nóng)科院王天宇團(tuán)隊利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將來源于高粱的外源基因SbSNAC1轉(zhuǎn)入玉米，獲得了耐旱轉(zhuǎn)基因玉米株系SbSNAC1-382。Southern雜交表明SbSNAC1-382是一個雙拷貝插入事件，兩個拷貝可能被插入到基因組的同一位置。在使用染色體步移法和全基因組測序法（WGS）檢測側(cè)翼序列失敗后，研究組采用單分子實時測序（single-molecule real-time，SMRT）技術(shù)成功鑒定出了外源片段的基因組側(cè)翼序列。研究人員首先構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因玉米基因組fosmid文庫，該文庫包含4.18×105個克隆，插入片段平均長度為35kb，覆蓋玉米基因組的5.85倍;然后，用特異性引物篩選出3個陽性克隆，并用單分子實時測序技術(shù)對其中1個進(jìn)行測序。研究人員將1.95Gb的測序數(shù)據(jù)（高達(dá)105倍覆蓋率）與玉米基因組和轉(zhuǎn)基因載體的序列進(jìn)行比對，確定了轉(zhuǎn)基因株系的插入位點(diǎn)，并用PCR擴(kuò)增和Sanger測序進(jìn)行了驗證。最后結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米SbSNAC1-382的兩個拷貝的外源T-DNA片段是整合在了5號染色體177155650～177155696位置處。

SMRT技術(shù)成功應(yīng)用于復(fù)雜轉(zhuǎn)化體插入位點(diǎn)和側(cè)翼序列的鑒定，為轉(zhuǎn)基因玉米的分子育種和安全評價提供了有效方案。