基于差示掃描量熱技術的板栗胚軸低溫保存技術及臨界含水量*

韓 彪 李文清 郭素娟 陸 璐 解孝滿

(1. 北京林業(yè)大學省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室 北京 100083； 2. 山東省林木種質資源中心 濟南 250102)

頑拗性種子(recalcitrant seed)主要是木本植物種子，一般體積較大，具有較高的經(jīng)濟價值，但頑拗性種子在成熟時多保持較高含水量，對脫水和低溫敏感，其保存技術一直是種子保存研究的重要方向(Lietal.， 2009； 文彬， 2011； 李磊等； 2016)。頑拗性種子無法長期保存的重要因素之一是脫水敏感性(Waltersetal., 2013; Xiaetal., 2014)，由于不同植物、同種植物不同種源種子的脫水耐受性都存在差異，傳統(tǒng)研究僅依據(jù)萌發(fā)的“臨界含水量”進行種子頑拗性評價的方法并不完善(Songetal., 2003)，出現(xiàn)了同種植物種子的結論迥然不同，甚至不同批次種子的結論也不同，如茶(Camelliasinensis)、小?？Х?Coffeaarabica)等都曾被劃分為不同種子類型(文彬， 2008)。因此，探索能夠客觀反映種子水分狀態(tài)和活力狀態(tài)的臨界含水量，針對不同類型種子研制適宜的保存技術，是頑拗性種子保存的重要研究方向。

板栗(Castaneamollissima)為殼斗科(Fagaceae)栗屬(Castanea)，是我國重要的木本糧食樹種，種植面積和產量均居世界第一(郭素娟等， 2018)。隨著板栗產量逐漸增大，其貯藏和保鮮能力不足問題日益凸顯， 許多栗農仍采取沙藏法、架藏法等傳統(tǒng)方法保存， 一些中小企業(yè)雖采用低溫貯藏技術，但由于貯前預處理、貯藏溫度、相對濕度等參數(shù)設置不夠科學，貯藏效果也不理想(易善軍， 2017)。胚軸是種子萌發(fā)的決定因素，是頑拗性種子超紙溫保存的核心材料，目前，已有一些關于板栗胚軸超低溫保存的報道(鄭郁善， 2002； Corredoiraetal., 2004)，但保存前臨界含水量未有研究，保存后種子萌發(fā)率不高。本研究基于差示掃描量熱技術(DSC)，分析頑拗性種子板栗胚軸的臨界含水量，探索板栗種子低溫保存技術和胚軸超低溫保存技術，以期為板栗等頑拗性種子設施保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年9月，從山東省濟南市西營板栗合作社采集‘煙泉’品種板栗種子，用紗布擦拭干凈后自封袋密封包裝，2 ℃下保存，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 胚軸脫水和含水量測定 選擇大小和質量[(10±0.5) g]一致的種子,首先去除種皮，用解剖刀切取含有小塊子葉組織的胚軸，將胚軸放在開放的培養(yǎng)皿(直徑7 cm)中，然后置于盛有硅膠的干燥器內，使用3個內置風扇增強干燥器內空氣循環(huán)，快速干燥胚軸。初始含水量測定參考國際種子檢驗協(xié)會(ISTA， 2018)方法，取10個新鮮胚軸稱取鮮質量后置于烘箱中(溫度103 ℃，烘干17 h)脫水至恒質量，稱取干質量后計算含水量=(鮮質量-干質量)/鮮質量×100%，重復3次。在硅膠密閉條件下使胚軸快速失水至50%、40%、30%、25%、20%、15%和10%等梯度含水量，均以新鮮胚軸初始含水量作為對照。

1.2.2 胚軸萌發(fā) 參考并改進Corredoira(2004)對歐洲板栗(C.sativa)胚軸的萌發(fā)方法，采用恢復培養(yǎng)基和萌發(fā)培養(yǎng)基進行板栗胚軸萌發(fā)，即將胚軸消毒后，首先接種在恢復培養(yǎng)基上24 h(改良的MS培養(yǎng)基，硝酸鹽減半，0.5 mg·L-16-BA，30 g·L-1蔗糖，1 mL·L-1，5 g·L-1瓊脂，pH 5.6)，然后轉接至萌發(fā)培養(yǎng)基上(瓊脂調整為6 g·L-1，其他成分同恢復培養(yǎng)基)。黑暗條件下培養(yǎng)2周，轉移到環(huán)境溫度為25 ℃的12 h/12 h光周期環(huán)境中培養(yǎng)2周，統(tǒng)計萌發(fā)率。胚軸萌發(fā)20個1組，重復3次。

1.2.3 基于DSC的熱力學分析 使用美國TA公司D250系列差示掃描量熱儀，對不同含水量胚軸進行熱力學測定，以液氮制冷。DSC測定參考Al等(2015)方法，將不同含水量胚軸樣品置于鋁盤內密封，在微量天平上稱質量； DSC分析條件為30 ℃ 保持1 min，以10 ℃·min-1降溫至-150 ℃后保持2 min，再以10 ℃·min-1升溫至30 ℃。基于DSC軟件監(jiān)測不同含水量胚軸在冷卻結晶和加熱熔融階段的熱力學數(shù)據(jù)，分析結晶起始溫度、峰值溫度和熱焓，根據(jù)不同含水量胚軸熱焓變化計算脫水臨界含水量。每個含水量梯度3次重復。

1.2.4 種子低溫保存 將采集的板栗種子用紗布擦拭干凈后密封保存在自封袋中，置于冰箱保鮮層。根據(jù)前期預試驗，保存溫度設為2 ℃，定期擦拭自封袋內產生的凝結水，每月測定種子發(fā)芽率，連續(xù)5個月。由于板栗種子存在休眠現(xiàn)象，因此采用組織塊萌發(fā)方式，即在黑暗條件下培養(yǎng)2周后，轉移到環(huán)境溫度為25 ℃的12 h/12 h光周期環(huán)境中培養(yǎng)2周，統(tǒng)計萌發(fā)率。種子萌發(fā)10個1組，重復3次。

1.2.5 胚軸超低溫保存 采用直接冷凍法、程序冷凍法、玻璃化冷凍法和程序玻璃化冷凍法，對不同含水量板栗胚軸進行超低溫保存測定。

直接冷凍法： 將胚軸放入凍存管，直接投入液氮中保存。程序冷凍法： 將胚軸放入凍存管，置于-80 ℃冰箱24 h，取出后迅速投入液氮中保存。玻璃化冷凍法： 將胚軸放入加有玻璃化冷凍保護劑PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%二甲亞砜+0.4 mol·L-1蔗糖)的凍存管內1 h，之后迅速投入液氮中保存。程序玻璃化冷凍法： 先將胚軸放入加有玻璃化冷凍保護劑PVS2的凍存管內1 h，然后置于-80 ℃冰箱24 h，最后投入液氮中保存。各種冷凍方法均在液氮中保存24 h。

解凍程序： 取出液氮保存24 h的胚軸，將凍存管置于40 ℃水浴中解凍5 min，含有PVS2的胚軸用無菌水洗滌3次，每次5 min。所有胚軸進行萌發(fā)測定，以未經(jīng)液氮保存的不同含水量胚軸萌發(fā)為對照(CK)，每組20個胚軸，重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和ANOVA對胚軸萌發(fā)和DSC數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，使用差示掃描量熱儀(DSC)TRIOS V4軟件(TA，USA)對熱力學曲線數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同含水量胚軸萌發(fā)情況

由圖1可知，當胚軸含水量從初始的61%降至25%時，胚軸萌發(fā)率未明顯下降； 當含水量降至20%時，萌發(fā)率降至82.1%，與鮮樣相比下降18.8%，說明板栗胚軸活力開始下降的臨界含水量在20%～25%之間； 當含水量降至10%時，萌發(fā)率降至25.6%，大部分胚軸失去萌發(fā)能力，與正常種子脫水至含水量10%以下不影響萌發(fā)率的現(xiàn)象成鮮明對比。

圖1 不同含水量胚軸的萌發(fā)率Fig.1 Germination rate of embryo axis at different moisture content

2.2 熱力學特征分析

DSC熱分析顯示，隨著胚軸含水量降低，結晶起始溫度、峰值溫度和熱焓均呈規(guī)律性下降趨勢，二者呈顯著正相關 (相關系數(shù)分別為r1=0.86、r2=0.83、r3=0.99)(圖2、表1)。此外，冷卻結晶階段峰值溫度低于加熱熔融階段，說明不同含水量胚軸降溫過程中形成結晶的溫度低于升溫過程中結晶融解的溫度，胚軸在放熱和吸熱過程中存在結晶溫度差異。

由表1可知，在冷卻結晶階段，未經(jīng)脫水的胚軸結晶起始溫度為-10.6 ℃，峰值溫度為-12.0 ℃，熱焓為170.2 J·g-1dw，對應的胚軸含水量為61%。當含水量降至25%時，結晶起始溫度降至-37.2 ℃，峰值溫度降為-44.1 ℃，熱焓僅為5.0 J·g-1dw，這說明在脫水過程中可結晶水含量急劇下降，結晶溫度顯著降低，因此，胚軸含水量在一定范圍內越低時產生的結晶傷害風險越小，越有利于種子的低溫保存。 當胚軸含水量降至20%及以下時，沒有結晶峰產生。加熱熔融階段熱力學特征也符合這一規(guī)律。

圖2 不同含水量胚軸熱分析Fig.2 Thermograms of embryo axes at different moisture content

胚軸含水量Embryo axis moisture content(%)冷卻結晶階段Cooling crystallisation加熱熔融階段Heating melting起始溫度Onset temperature/℃峰值溫度Peak temperature/℃熱焓Enthalpy/(J·g-1 dw)起始溫度Onset temperature/℃峰值溫度Peak temperature/℃熱焓Enthalpy/(J·g-1 dw)61(對照Control)-10.6±1.0a-12.0±1.0a170.2±11.3a-5.6±0.4a0±0.4a165.9±11.2a50-12.9±1.2b-14.7±1.5b114.8±13.6b-9.4±0.9b-2.5±0.7b120.2±11.9b40-16.1±2.4bc-17.2±3.3b61.4±13.9c-15.9±1.6c-5.7±2.2b68.1±12.2c30-20.9±0.3c-23.5±1.6c36.2±10.9c-21.7±4.3c-8.7±0.9c43.0±7.9d25-37.2±0c-44.1±0c5.0±0d-24.9±1.2d-16.5±2.7d13.4±11.8e20無結晶峰No peak無結晶峰No peak無結晶峰No peak無結晶峰No peak無結晶峰No peak無結晶峰No peak15無結晶峰No peak無結晶峰No peak無結晶峰No peak無結晶峰No peak無結晶峰No peak無結晶峰No peak10無結晶峰No peak無結晶峰No peak無結晶峰No peak無結晶峰No peak無結晶峰No peak無結晶峰No peak

圖3 不同含水量胚軸冷卻結晶(A)和加熱熔融(B)階段的熱焓Fig.3 The enthalpy of cooling crystallisation (A) and heating melting (B) of embryonic axes at different moisture content

2.3 臨界含水量

種子(胚)低溫保存的主要傷害來自于細胞內外自由水結晶(冰晶)對細胞膜的破壞(Hamiltonetal., 2009; Aletal., 2015)，因此在低溫條件下保存板栗胚軸時應盡量避免產生結晶傷害。本研究以冷卻結晶(圖3A)和加熱熔融(圖3B)階段的胚軸含水量為橫坐標，以對應的熱焓為縱坐標，建立熱焓圖，其中趨勢線與X軸交叉點即為結晶臨界含水量。在冷卻結晶階段臨界含水量為23.9%，在加熱熔融階段臨界含水量為21.6%，二者非常接近，且均處于含水量20%～25%區(qū)間。由于自由水結晶傷害主要來自冷卻結晶階段，因此推斷‘煙泉’品種板栗的臨界含水量為23.9%。

2.4 種子低溫保存

根據(jù)DSC數(shù)據(jù)推測，將新鮮種子保存在產生冷卻結晶溫度之上的低溫環(huán)境中，不會影響種子活力。如圖4所示，在2 ℃低溫環(huán)境下，保存6個月的板栗種子萌發(fā)率達93.3%。種子萌發(fā)率、胚根和胚芽長度沒有顯著差異(P>0.9)。在此溫度下將板栗種子保存至第2年春天進行播種繁育，可有效解決頑拗性種子板栗的短期保存問題。

2.5 胚軸超低溫保存

根據(jù)不同含水量胚軸的萌發(fā)結果和DSC熱力學數(shù)據(jù)，對不同含水量胚軸進行液氮超低溫保存，其萌發(fā)率見表2。對于不同方法超低溫保存的胚軸，當含水量在20%及以上時，所有方法均沒有萌發(fā)，說明此時胚軸在超低溫保存過程中受到了嚴重冰凍傷害。當含水量低于20%時，超低溫保存的胚軸部分萌發(fā)，在4種超低溫保存方法中，直接冷凍法和程序冷凍法的萌發(fā)率較低，一般低于10%； 玻璃化冷凍法和程序玻璃化冷凍法的萌發(fā)率相對較高，在15%～25%之間，說明采用玻璃化冷凍保護液PVS2處理可提高胚軸超低溫保存后的成活率。由于含水量較低時(20%以下)胚軸會遭受脫水傷害，含水量較高時(20%以上)胚軸會遭受冷凍傷害，所以尋找一個合適的平衡點，并結合改進保存技術，是板栗種子和胚軸成功保存的關鍵。

圖4 低溫保存板栗種子萌發(fā)情況Fig.4 Germination of chestnut seed at low temperature storage

表2 不同含水量胚軸超低溫保存的萌發(fā)率Tab.2 Germination rate of embryo axes after cryopreservation at different moisture content

3 討論

頑拗性種子保存難度大，其主要原因是其脫水敏感性，無法像正常性種子那樣耐受脫水，種子(胚)含水量是決定頑拗性種子生活力及保存壽命的關鍵因素 (Xiaetal., 2012; Jinetal., 2018)。殼斗科植物種子是溫帶地區(qū)常見的頑拗性種子，Xia等(2014)比較中國和美國4種櫟(Quercus)類頑拗性胚軸耐逆性影響因素，認為胚芽比胚根在切除部位、脫水耐性和低溫耐性方面更加敏感。陶月良等(2004)研究板栗種子成熟前后脫水敏感性與可溶性糖、蛋白質之間的關系，發(fā)現(xiàn)子葉和胚軸的可溶性蛋白譜帶存在較大差異，子葉含有較多的熱穩(wěn)定蛋白。宗梅等(2010)研究不同發(fā)育階段板栗種子的脫水敏感性，結果表明，板栗開花后90天種子中淀粉降解，可溶性糖含量增加，胚軸中可溶性蛋白也大量降解，推斷種子已轉入萌發(fā)狀態(tài)，由此認為脫水敏感性與細胞膜透性并不完全相關。然而，Chen等(2018)對板栗、豌豆(Pisum)等多種頑拗性種子和正常種子對比分析后發(fā)現(xiàn)，細胞膜中磷脂酶Dα1介導的磷脂酸缺失是脫水誘導種子活力喪失的決定因素。可見，目前研究結果還未形成一個成熟的理論體系闡釋頑拗性種子脫水敏感性機制，而研究重點又多集中于種子發(fā)育階段和機制研究，對頑拗性種子臨界含水量探索較少且觀念不一，因此，需在種子萌發(fā)基礎上，結合DSC等技術手段，優(yōu)化臨界含水量的測定方法。

差示掃描量熱技術(DSC)是分析種子和胚軸水分熱力學變化的有效工具。種子或胚軸脫水過程中有 結晶起始溫度、結晶峰和未凍結含水量3個關鍵點，結晶峰的形成意味著胚軸組織冰晶傷害(Horetal., 2005; Nadarajanetal., 2008; Aletal., 2015)。本研究基于DSC，結合種子脫水萌發(fā)情況，測定‘煙泉’品種板栗胚軸的臨界含水量為23.9%，故在沒有特殊保護措施情況下，應避免將胚軸脫水至該含水量以下，以免產生脫水傷害。同時，熱力學特征表顯示，未經(jīng)處理的板栗胚軸，冷卻結晶平均起始溫度為-10.6 ℃，理論上保存溫度高于該溫度就不會形成冰晶傷害，但是由于-10.6 ℃為平均值，不同個體之間冷卻結晶起始溫度可能存在差異，為了避免對不同個體的冷凍傷害，且方便生產實踐應用(普通冰箱冷藏室)，本研究將板栗用自封袋密封保存在2 ℃環(huán)境中，定期擦拭凝結水，低溫保存6個月的種子萌發(fā)率和種苗性狀基本無變化，種子生活力不受影響，為短期保存板栗種子提供了可能，該方法簡單易行，可用于生產中板栗春季播種育苗的種子保存。利用DSC技術可測定頑拗性種子臨界含水量，確定種子最適保存溫度和保存含水量，該方法準確、快速、簡便，可考慮作為頑拗性種子臨界含水量的測定方法。

超低溫是頑拗性種子保存的可行途徑，對于栗屬植物超低溫保存研究也有一些報道。Pence(1999)對7屬18種溫帶頑拗性種子進行超低溫保存，發(fā)現(xiàn)栗、山核桃(Carya)、櫟這3個屬植物可獲得完全愈傷組織。鄭郁善等(2002)對比不同冷凍處理和解凍處理流程對板栗胚軸生活力的影響，得出各種解凍方式之間差異較小，含水量20%的胚軸萌發(fā)率最高為25%。Corredoira等(2004)對歐洲板栗合子胚和體胚進行超低溫保存研究，結果發(fā)現(xiàn)合子胚含水量20%～24%時成活率較好，達63%。本研究采用4種冷凍方式對板栗胚軸進行超低溫保存，顯示使用玻璃化冷凍法的胚軸萌發(fā)率明顯高于直接冷凍法，說明玻璃化冷凍法更適合板栗胚軸保存。另外，無論是歐洲板栗、中國板栗還是中國板栗的不同品種之間，其超低溫保存條件都存在一定差異，且超低溫保存后恢復培養(yǎng)成苗率均存在較大幅度下降，說明目前的超低溫保存方法還不能長期有效保存板栗資源，仍需進一步探索完善。基于DSC的種子低溫保存，可作為現(xiàn)階段板栗等頑拗性種子短期保存和生產應用的有效途徑。

4 結論

板栗胚軸含水量降至20%及以下會對胚軸萌發(fā)活力產生影響，屬于典型頑拗性種子?；诓钍緬呙枇繜峒夹g，結合不同含水量胚軸萌發(fā)情況，可有效確定板栗等頑拗性種子的臨界含水量，‘煙泉’品種板栗胚軸的臨界含水量為23.9%。板栗種子在2 ℃低溫密封保存條件下可有效保存6個月以上，其萌發(fā)率、胚根和胚芽長度無顯著變化。加入冷凍保護劑PVS2可提高板栗胚軸超低溫保存后的萌發(fā)率。