不同酵母菌株發(fā)酵藍(lán)莓酒有機酸的動態(tài)變化研究

屈嬡，滿都拉，孫子羽，忻勝兵，趙雪妮，袁文艷，陳忠軍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

藍(lán)莓，屬杜鵑花科越橘亞科多年生落葉或常綠灌木，因果實多為藍(lán)色而得名。其果實為漿果，呈深藍(lán)色、果皮附白霜、近圓形、皮薄籽小，富含花青素和總酚等營養(yǎng)物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價值，具有防止神經(jīng)衰老、增強心臟功能、明目及抗癌的獨特功效[1]。普遍來說，藍(lán)莓果實口感偏酸，對釀酒微生物有一定的影響，這也是發(fā)酵藍(lán)莓酒的開發(fā)生產(chǎn)中存在的主要問題之一[2]。有機酸的組成與含量決定藍(lán)莓果酒的風(fēng)味和品質(zhì)[3]，有機酸的含量、發(fā)酵過程中的演變與調(diào)控是藍(lán)莓酒品質(zhì)控制的關(guān)鍵因素之一，因此檢測藍(lán)莓果酒中有機酸的變化極為重要。

藍(lán)莓酒的獨特釀造工藝和原料早造就了藍(lán)莓酒獨特的香氣特征。藍(lán)莓發(fā)酵釀造的果酒揮發(fā)性物質(zhì)十分豐富，包括醇類、酯類、酸類、羥基化合物、酚類、內(nèi)酯、萜等幾大類，它們氣味各異，并進(jìn)一步通過增效、協(xié)同、分離和抑制等相互作用使果酒香氣呈現(xiàn)多種多樣的特點[4-6]。有機酸本身所具有特殊口味與酸味，使得其對果酒風(fēng)味影響的重要性僅次于酯類。有機酸的存在，不僅可以加速多糖的轉(zhuǎn)化和果膠物質(zhì)的分解，還能促進(jìn)果酒的老熟和澄清[7-9]；能與酒精起酯化反應(yīng)生成酯，使果酒具有酯香；能使果酒具有清涼爽口的風(fēng)味[10-11]。另外，果酒中的酵母菌自身還能夠產(chǎn)生芳香活性化合物，而改善果酒的最后的香氣和風(fēng)味[12]。以往對藍(lán)莓酒風(fēng)味的研究主要是對成品酒體中的風(fēng)味物質(zhì)含量的研究，鮮見對藍(lán)莓酒發(fā)酵過程中有機酸和揮發(fā)性物質(zhì)的動態(tài)變化的報道[13]。本研究對不同酵母菌發(fā)酵藍(lán)莓酒過程中跟蹤取樣，采用高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC） 法測定不同酵母發(fā)酵藍(lán)莓果酒過程中9 種有機酸含量，以及酒精發(fā)酵結(jié)束后藍(lán)莓果酒中的有機酸類物質(zhì)，為進(jìn)一步研究藍(lán)莓酒發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的形成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生藍(lán)莓：內(nèi)蒙古根河野生資源開發(fā)公司。

菌株：T1、FK3-2、GF3 均從根河的野生藍(lán)莓基地的藍(lán)莓果皮獲取，T1 為實驗室篩選改良的耐高糖釀酒酵母菌株；FK3-2 為實驗室篩選改良的耐酸釀酒酵母；GF3 為實驗室篩選改良的耐高酒精釀酒酵母。

檸檬酸、檸檬酸鈉（食品級）、焦亞硫酸鉀、白砂糖（市售）、甲醇（色譜純）、草酸、酒石酸、D-蘋果酸、L-蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、冰乙酸、檸檬酸、L-焦谷氨酸、琥珀酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.0 mg/mL）；草酸、酒石酸、DL-蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、冰乙酸、檸檬酸、L-焦谷氨酸、琥珀酸（分析純）：百靈威科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2104N 電子分析天平：北京海天友誠科技有限公司；G7129A 液相色譜分析儀：Agilent Technologies Singapore；PHS-3C pH 計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PO-100/PO-1000 單道移液槍：梅特勒-托利多上海儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

冷凍藍(lán)莓果→篩選→解凍→稱量→榨汁→酶解（加果膠酶）→調(diào)節(jié)成分（加偏重亞硫酸鉀、糖，調(diào)節(jié)pH值）→接種→主發(fā)酵→倒罐→后發(fā)酵→陳釀→澄清→成品

1.3.2 樣品的制備及檢測

取適量的冷凍藍(lán)莓果常溫解凍，解凍后用榨汁機打碎，經(jīng)預(yù)試驗后確定用1∶1（體積比）比例的蒸餾水混勻，按照0.03 g/L 添加果膠酶恒溫酶解2 h，酶解完添加120 mg/L 的SO2，調(diào)整初始糖量為32.2 BX，調(diào)節(jié)發(fā)酵醪液初始pH 值為3.5，按照7%接種量分別添加活化好的 T1、FK3-2、GF3，在 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵28 d 前發(fā)酵終止。再將前發(fā)酵結(jié)束的藍(lán)莓酒倒灌放入20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中后發(fā)酵28 d，然后倒桶低溫冷藏陳釀澄清一段時間，最后得到高酒精度的藍(lán)莓酒。在樣品前后發(fā)酵期間每隔7 d 取一次樣，進(jìn)行成分測定[13-14]。

1.3.3 液相色譜條件

取樣品25 mL，加入適量活性炭進(jìn)行吸附，再使用真空抽濾機進(jìn)行抽濾，最后用0.22 μm 級濾膜過濾。液相色譜條件：利用C18色譜柱分析9 種有機酸，選擇0.08 mol/L 磷酸二氫鉀（pH2.9）做流動相，流動相流速為0.30 mL/min，柱溫為40 ℃，紫外檢測波長為210 nm[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中草酸的變化

3 種酵母菌發(fā)酵過程中草酸的含量變化如圖1所示。

由圖1 可知，T1 酵母菌在前酵期結(jié)束階段草酸含量最高，而后酵過程中草酸有下降趨勢，其后酵結(jié)束后的酒體中草酸含量比初始發(fā)酵醪液中含量高；FK3-2 酵母菌在發(fā)酵過程中的草酸含量變化趨勢與T1 酵母菌相似，但比T1 酵母菌的含量少；GF3 酵母菌在發(fā)酵過程中后酵期14 d 時草酸含量最高，后酵期21 d 時含量最低，后酵結(jié)束時的酒體中草酸含量比發(fā)酵醪液中的初始含量高。綜上來看，3 種不同酵母后酵結(jié)束后都會導(dǎo)致藍(lán)莓酒液中的草酸含量增加，這與包蓉[17]的酒精發(fā)酵結(jié)束后草酸的含量都會有顯著增加的研究結(jié)論相一致。

圖1 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中草酸含量的變化Fig.1 Changes in oxalic acid content during fermentation of blueberry wine

2.2 發(fā)酵過程中酒石酸的變化

3 種酵母菌發(fā)酵過程中酒石酸的含量變化如圖2所示。

圖2 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中酒石酸含量的變化Fig.2 Changes of tartaric acid content during fermentation of blueberry wine

從圖2 可知，T1 與FK3-2 酵母菌發(fā)酵過程中酒石酸的含量變化趨勢大體一致。在前酵期28 d 酒石酸含量有明顯差別，GF3 酵母菌發(fā)酵過程中酒石酸的含量變化較前兩者都大，后酵結(jié)束后酒體中的酒石酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于初始發(fā)酵醪液中的酒石酸含量。綜合來看，后酵結(jié)束，酒石酸的含量都有所增高，這與包蓉[17]的酒精發(fā)酵結(jié)束后酒石酸的含量都會有顯著增加的研究結(jié)論相一致，且GF3 酒體中的酒石酸含量增高的比較顯著。

2.3 發(fā)酵過程中蘋果酸的變化

3 種酵母菌發(fā)酵過程中蘋果酸的含量變化如圖3所示。

如圖3 所示，T1 酵母菌發(fā)酵過程中蘋果酸的含量變化趨勢最大，在前發(fā)酵期14 d 時含量最高，后酵期7 d 時含量最低；FK3-2 酵母菌發(fā)酵過程中蘋果酸的含量變化較穩(wěn)定，在前酵期28 d 時蘋果酸的含量最低，后酵結(jié)束后，蘋果酸的含量與初始醪液相比有所下降；GF3 酵母發(fā)酵過程中蘋果酸的含量明顯增高，但在后酵結(jié)束后蘋果酸的含量與初始醪液相比也有所下降；綜上來看，3 株菌在發(fā)酵過程中蘋果酸含量變化趨勢各有不同，但在后酵結(jié)束后蘋果酸的含量都比發(fā)酵醪液中初始蘋果酸含量低，這可能是由于發(fā)酵過程中酵母菌具有代謝產(chǎn)生蘋果酸的功能[18]。

圖3 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中蘋果酸含量的變化Fig.3 Changes of malic acid content during the fermentation of blueberry wine

2.4 發(fā)酵過程中α-酮戊二酸的變化

3 種酵母菌發(fā)酵過程中α-酮戊二酸的含量變化如圖4 所示。

圖4 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中α-酮戊二酸含量的變化Fig.4 Changes of α-ketoglutaric acid content during fermentation of blueberry wine

如圖4所示，T1、FK3-2、GF3 酵母菌發(fā)酵過程中α-酮戊二酸的含量變化趨勢走向基本一致。其中GF3酵母菌發(fā)酵過程中α-酮戊二酸的含量最高，后酵結(jié)束后，GF3 酵母菌發(fā)酵的酒體中α-酮戊二酸的含量最高，其次是T1、FK3-2 含量較低；藍(lán)莓酒發(fā)酵過程中α-酮戊二酸的含量的增加可以為果酒提供有機酸的豐富性，并為果酒具有很強的抗氧化能力奠定基礎(chǔ)[19]。

2.5 發(fā)酵過程中乳酸的變化

3 種酵母菌發(fā)酵過程中乳酸的含量變化如圖5所示。

圖5 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中乳酸含量的變化Fig.5 Changes in lactic acid content during fermentation of blueberry wine

如圖5 所示，T1 酵母菌發(fā)酵過程中乳酸的含量最少，其次是FK3-2 酵母菌發(fā)酵過程中乳酸含量居中，GF3 酵母菌發(fā)酵過程中乳酸含量最高；后酵結(jié)束后，T1、FK3-2 酵母菌發(fā)酵的酒體中乳酸的含量與發(fā)酵醪液中初始的乳酸含量相比有少量增長，GF3 酵母菌發(fā)酵的酒體中乳酸的含量與發(fā)酵醪液中初始的乳酸含量相比顯著增高。綜上來看，整個發(fā)酵過程中乳酸的含量變化趨于增長的趨勢，這說明了乳酸是果酒發(fā)酵中波動較大的有機酸[20]。

2.6 發(fā)酵過程中乙酸的變化

3 種酵母菌發(fā)酵過程中乙酸的含量變化如圖6所示。

圖6 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中乙酸含量的變化Fig.6 Changes in acetic acid content during fermentation of blueberry wine

如圖6 所示，T1 酵母菌發(fā)酵過程中乙酸的含量變化趨勢波動最顯著。在前酵期14 d 時達(dá)到最高，比兩者酵母菌同階段的乙酸含量均高出很多；FK3-2、GF3酵母菌發(fā)酵過程中乙酸的含量變化趨勢大徑相同；后酵結(jié)束后，GF3 酵母菌發(fā)酵的酒體中乙酸含量最高，其他兩株菌的乙酸含量幾乎相同。由以上結(jié)果來看，不同酵母菌發(fā)酵過程中的乙酸的含量變化趨勢不同。由于乙酸是果酒中具有揮發(fā)性的有機酸之一，過量的乙酸必然造成成品酒揮發(fā)酸值超標(biāo)。不同釀酒酵母產(chǎn)乙酸的能力差異較大，因此發(fā)酵過程中所選用的酵母也是影響藍(lán)莓果酒中乙酸含量高低的一個重要因素[21]。而酵母產(chǎn)乙酸的能力還與發(fā)酵原料中糖的濃度密切相關(guān)，糖濃度越高，酵母發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸的含量就越高。因此，對藍(lán)莓果酒而言，選擇較低的糖濃度進(jìn)行發(fā)酵，可能更有利于其產(chǎn)品的質(zhì)量。即使藍(lán)莓果酒酵母能夠產(chǎn)生一些乙酸，其產(chǎn)生水平也不會超過法規(guī)的限量[22]。乙酸物質(zhì)是釀酒酵母在生長與繁殖過程所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，乙酸次生代謝產(chǎn)物的含量是評定果酒優(yōu)良品質(zhì)的重要指標(biāo)[21]。

2.7 發(fā)酵過程中檸檬酸的變化

3 種酵母菌發(fā)酵過程中檸檬酸的含量變化如圖7所示。

圖7 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中檸檬酸含量的變化Fig.7 Changes in citric acid content during fermentation of blueberry wine

從圖7 可以看出，T1 酵母菌發(fā)酵過程中檸檬酸的含量變化趨勢波動較小，F(xiàn)K3-2、GF3 發(fā)酵過程中檸檬酸的含量變化趨勢基本一致，在前酵期先大幅度增高再迅速降低，前酵期7 d 時GF3 酵母菌的發(fā)酵醪液中檸檬酸的含量明顯高于其它菌株；后酵結(jié)束后，3 種酵母菌發(fā)酵的酒體中的檸檬酸含量幾乎一樣，比初始發(fā)酵醪液中含量高將近一倍左右。據(jù)報道適當(dāng)濃度的檸檬酸可以提高藍(lán)莓果酒中花青素的穩(wěn)定性，其主要表現(xiàn)在以下兩方面：一方面是檸檬酸降低體系pH 值，使花青素處于穩(wěn)定的陽離子狀態(tài)；另一方面檸檬酸與花青素中羥基發(fā)生?；磻?yīng)，降低其反應(yīng)活性，提高藍(lán)莓酒的穩(wěn)定性和抗氧化活性[22]，且對果酒酸味起較大貢獻(xiàn)作用，所以后發(fā)酵結(jié)束后的藍(lán)莓果酒的酸味口感有所提升[23]。

2.8 發(fā)酵過程中焦谷氨酸的變化

3 種酵母菌發(fā)酵過程中焦谷氨酸的含量變化如圖8 所示。

如圖8 所示，T1、FK3-2 酵母菌發(fā)酵過程中焦谷氨酸的含量變化趨勢大體上基本一致，GF3 酵母菌焦谷氨酸的含量變化波動幅度較大，前發(fā)酵期28 d 時含量最高；后酵結(jié)束，三者發(fā)酵的酒體中的焦谷氨酸的含量都比初始發(fā)酵醪液中降低了很多，其中GF3 發(fā)酵的酒體中焦谷氨酸含量略高，而T1、FK3-2 酒體中的焦谷氨酸含量接近0。焦谷氨酸對皮膚有保濕作用，焦谷氨酸可以抑制酪氨酸氧化酶的活性，阻止“類黑素”物質(zhì)在皮膚中沉積，有美白皮膚的作用，此外，焦谷氨酸還有角質(zhì)軟化作用[24]，由此來看，GF3 酵母菌發(fā)酵的藍(lán)莓酒更益于人們飲用。

圖8 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中焦谷氨酸含量的變化Fig.8 Changes of pyroglutamic acid content during fermentation of blueberry wine

2.9 發(fā)酵過程中琥珀酸的變化

3 種酵母菌發(fā)酵過程中琥珀酸的含量變化如圖9所示。

圖9 藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中琥珀酸含量的變化Fig.9 Changes in succinic acid content during fermentation of blueberry wine

如圖9 所示，T1 酵母菌發(fā)酵過程中琥珀酸的含量變化趨勢波動最小，F(xiàn)K3-2 酵母菌發(fā)酵過程中琥珀酸的含量變化趨勢波動較大，在前酵期7 d 時琥珀酸的含量增長到最高，GF3 酵母菌發(fā)酵過程中琥珀酸的含量變化趨勢波動最大；后酵結(jié)束后，GF3 酵母菌發(fā)酵的酒體中的琥珀酸含量最高?？傮w上來看，后酵結(jié)束，琥珀酸的含量增高。這一結(jié)果與趙國群[24]等的試驗結(jié)果一致。釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中，代謝消耗了部分草酸，同時產(chǎn)生乳酸和琥珀酸，在葡萄酒的酒精發(fā)酵過程中，酵母菌發(fā)酵過程中也會產(chǎn)生乳酸和琥珀酸。2.10 發(fā)酵過程中有機酸總含量的變化

3 種酵母菌發(fā)酵過程中有機酸總含量的變化如圖10 所示。

圖10 藍(lán)莓酒發(fā)酵過程中9 種有機酸總含量的變化Fig.10 Changes in the total content of nine organic acids in the fermentation of blueberry wine

在不同發(fā)酵階段不同酵母菌發(fā)酵醪液中的9 種有機酸總含量是有區(qū)別的，前酵期7 d 時含量均有增加，但是 T1 含量最低，GF3 含量最高；14 d 時除 T1 有所上升外，其他均大幅度下降；28 d 時3 株菌均達(dá)到第二個峰值，且GF3 含量最高；到后酵初期有機酸含量均下降，后酵14 d 時T1 和FK3-2 總酸含量均上升，而GF3繼續(xù)下降，后酵28 d 時T1 和FK3-2 總酸含量略有下降，均為12 g/L 左右，而GF3 達(dá)到較高值，為20.9 g/L。前發(fā)酵結(jié)束后3 株菌總酸含量均高于初始發(fā)酵醪液，其中GF3 最高，其他兩株非常接近。后發(fā)酵結(jié)束后T1和FK3-2 發(fā)酵的酒體中總酸含量仍沒有差別，而GF3發(fā)酵酒體中總酸含量最高，是其他兩種的兩倍以上，且總酸量低于前發(fā)酵酒。總之3 株菌株發(fā)酵結(jié)束后藍(lán)莓酒體中的9 種有機酸的總含量比初始發(fā)酵醪液明顯增高。且藍(lán)莓酒體中的主要有機酸含量因釀酒酵母的種類不同而有差別[25]。

3 結(jié)論

通過研究在發(fā)酵過程中有機酸含量變化發(fā)現(xiàn)，不同酵母菌株發(fā)酵過程中9 種有機酸的含量有著明顯的差異，且發(fā)酵各個階段9 種有機酸總含量變化趨勢也有所不同。前發(fā)酵結(jié)束時，3 株菌發(fā)酵的藍(lán)莓酒體中9種有機酸含量均高于初始發(fā)酵醪液，其中GF3 最高，T1、FK3-2 非常接近。后發(fā)酵結(jié)束時，3 株不同菌株酒體中9 種有機酸的含量低于主發(fā)酵結(jié)束時含量，均高于初始發(fā)酵醪液，且T1 和FK3-2 有機酸含量幾乎沒有差別，而GF3 發(fā)酵酒體中有機酸含量最高，3 株菌中GF3 發(fā)酵的酒體中9 種有機酸的含量及總含量都較高。檢測不同酵母發(fā)酵藍(lán)莓酒過程中有機酸含量的變化為選擇良好的藍(lán)莓酒發(fā)酵酵母奠定了基礎(chǔ)。