稀釋蝰蛇毒時(shí)間試驗(yàn)與混合試驗(yàn)在狼瘡抗凝物檢測(cè)中的相關(guān)性研究

術(shù) 超，管甲亮，李 喆，劉 禹，王學(xué)鋒，武文漫

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院急診內(nèi)科，山東 青島 266071）

狼瘡抗凝物是一種能直接與磷脂或其復(fù)合物相結(jié)合的異質(zhì)性免疫球蛋白，是抗磷脂抗體的一種，可見于多種自身免疫性疾病[1]。狼瘡抗凝物持續(xù)陽(yáng)性的患者被認(rèn)為有較高的血栓形成和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。狼瘡抗凝物的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)包括篩查試驗(yàn)、混合試驗(yàn)、確證試驗(yàn)等，基于共同途徑原理的稀釋蝰蛇毒時(shí)間（diluted Russell viper venom time，dRVVT）法和基于內(nèi)源途徑及共同途徑的活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）法是目前臨床實(shí)驗(yàn)室最常采用的2 種檢測(cè)方法[2]。同時(shí)，美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）指出，當(dāng)篩查結(jié)果不明確時(shí)，混合試驗(yàn)可以幫助鑒別診斷凝血因子缺陷及其抑制物的存在，可提高實(shí)驗(yàn)診斷的準(zhǔn)確率[2-3]。本研究擬探索確證試驗(yàn)dRVVT 標(biāo)準(zhǔn)化比值與混合試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果間的相關(guān)性及方法學(xué)特點(diǎn)。

資料與方法

一、資料

在2015 年9 月至2019 年9 月期間，收集在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院連續(xù)就診的31 例凝血功能異常（APTT 篩選試驗(yàn)結(jié)果大于正常參考上限38.7 s）、狼瘡抗凝物篩查及確證試驗(yàn)陽(yáng)性患者的臨床資料。在31 例患者中，男性10 例，女性21 例；年齡為15～74 歲，中位年齡為53 歲，呈偏態(tài)分布。所有患者就診時(shí)均無(wú)血栓及出血的臨床表現(xiàn)，且在采血前2 周內(nèi)未使用肝素、華法林、阿司匹林等抗凝藥物。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

二、方法

1.標(biāo)本采集：用109 mmol/L 枸櫞酸鈉抗凝管（枸櫞酸鈉與血液比例為1∶9）采集外周靜脈血2.7 mL，并充分混勻，標(biāo)本應(yīng)無(wú)溶血、凝固、乳糜等現(xiàn)象。行3 000 r/min 離心10 min 后，分離乏血小板血漿，樣本采集后2 h 內(nèi)完成測(cè)定。

2.狼瘡抗凝物篩選試驗(yàn)：應(yīng)用Sysmex CS 5100全自動(dòng)凝血分析儀及其配套試劑，基于凝固法測(cè)得APTT（以低濃度磷脂為激活劑）作為狼瘡抗凝物的篩選實(shí)驗(yàn)。如果APTT 明顯延長(zhǎng)（大于正常參考值上限38.7 s)，則根據(jù)CLSI 關(guān)于狼瘡抗凝物的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指南進(jìn)行狼瘡抗凝物的確證試驗(yàn)。

3.狼瘡抗凝物確證試驗(yàn)：采用ACL TOP-700（美國(guó)Werfen Instrumentation Laboratory 公司）全自動(dòng)凝血分析儀及其配套試劑測(cè)得dRVVT 標(biāo)準(zhǔn)化比值，以該值的大小表示狼瘡抗凝物的陽(yáng)性程度[2]。以上試驗(yàn)均嚴(yán)格按照儀器和試劑的說(shuō)明書進(jìn)行操作。篩查及確證試驗(yàn)dRVVT 的公式及參考范圍如下。dRVVT 篩選比值=患者dRVVT 篩選時(shí)間（s）/dRVVT 篩選正常均值（s）；dRVVT 確證比值=患者dRVVT 確證時(shí)間（s）/dRVVT 確證正常均值（s）；dRVVT 標(biāo)準(zhǔn)化比值=dRVVT 篩選比值/dRVVT 確證比值。篩選試驗(yàn)采用低磷脂濃度試劑，確證試驗(yàn)采用高磷脂濃度試劑，dRVVT 標(biāo)準(zhǔn)化比值的最佳臨界值為1.2。

4.混合試驗(yàn)：當(dāng)dRVVT 標(biāo)準(zhǔn)化比值大于1.2 時(shí)，高度提示狼瘡抗凝物陽(yáng)性，則進(jìn)一步行混合試驗(yàn)，也被稱為糾正試驗(yàn)。國(guó)際血栓與止血學(xué)會(huì)推薦檢測(cè)病人血漿（病漿）、正常血漿、1∶1 混合血漿（正常人與病漿），使用結(jié)果的比值Rosner 指數(shù)（也稱循環(huán)抗凝指數(shù)）來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)[2,4]。dRVVT 確證試驗(yàn)與混合試驗(yàn)均出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，可判定為狼瘡抗凝物陽(yáng)性。

混合試驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下。Rosner 指數(shù)（R）=（1∶1 混合血漿APTT 秒數(shù)-正常人血漿APTT 秒數(shù)）/病漿APTT 秒數(shù)×100%；R1=（即刻1∶1 混合血漿APTT 秒數(shù)-正常人血漿APTT 秒數(shù)）/病漿APTT 秒數(shù)×100%；R2=（孵育2 h 后1∶1 混合血漿APTT 秒數(shù)-正常人血漿APTT 秒數(shù)）/病漿APTT 秒數(shù)×100%（正常人血漿指20 人份正常人血漿制備正常人混合血漿；R1、R2>11 為抑制劑型、R1、R2<11 為因子缺乏型）。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 26.0 軟件、Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述、正態(tài)性檢驗(yàn)以及相關(guān)性分析（P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），應(yīng)用Graphpad Prism 8.0 繪圖軟件繪制統(tǒng)計(jì)結(jié)果。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)及圖形表示其分布及離散程度。

結(jié) 果

一、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

31 例患者的狼瘡抗凝物篩選試驗(yàn)APTT 值為42.5～91.0 s，均值為57.8 s；確證試驗(yàn)dRVVT 標(biāo)準(zhǔn)化比值為1.3～3.22，均值為2.28。正常人血漿的APTT 值為25.0～27.7 s，均值為26.4 s；1∶1 混合血漿即刻APTT 值為29.5～69.3 s，均值為46.8 s；1∶1混合血漿2 h APTT 值為29.9～75.2 s，均值為49.34 s。Rosner 指數(shù)（即刻，R1）為7.30～50.52，均值為33.81；Rosner 指數(shù)（2 h，R2）為8.60～61.72，為均值33.21，其具體分布見圖1。

二、檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析

繪制31 例患者dRVVT 標(biāo)準(zhǔn)化比值分別與病漿APTT 值、R1、R2 間關(guān)系的散點(diǎn)圖（見圖2），可以看出dRVVT 標(biāo)準(zhǔn)化比值分別與病漿APTT 值、R1 及R2值之間存在正相關(guān)性。進(jìn)一步應(yīng)用Pearson 相關(guān)性分析，計(jì)算其各自相關(guān)系數(shù)，具體結(jié)果見表1。dRVVT 標(biāo)準(zhǔn)化比值與病漿APTT 值、R1 及R2 值間顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r 值在0.54～0.62 之間，且P 值均小于0.05。

圖1 混合試驗(yàn)4 種血漿APTT 值及Rosner指數(shù)R1、R2 的分布情況

表1 dRVVT 標(biāo)準(zhǔn)化比值與混合試驗(yàn)結(jié)果間的相關(guān)性分析

討 論

一、狼瘡抗凝物的病理機(jī)制

狼瘡抗凝物由一組抗磷脂或抗磷脂結(jié)合蛋白的自身抗體所組成，與抗心磷脂抗體和抗β2糖蛋白I 抗體密切相關(guān)。在體外凝血功能試驗(yàn)中，狼瘡抗凝物通過(guò)與凝血因子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合磷脂表面來(lái)抑制凝血反應(yīng)，導(dǎo)致凝血反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)。最早狼瘡抗凝物是在具有出血傾向的系統(tǒng)系紅斑狼瘡患者中被發(fā)現(xiàn)，但其發(fā)生與系統(tǒng)性自身免疫疾病并不完全相關(guān)。同時(shí)，與正常人群相比，絕大多數(shù)狼瘡抗凝物陽(yáng)性患者的出血風(fēng)險(xiǎn)并未增加，反而更容易罹患血栓性疾病[5]。雖然狼瘡抗凝物的存在導(dǎo)致體外凝血試驗(yàn)所測(cè)定的凝血反應(yīng)活性下降，但其在體內(nèi)對(duì)同樣發(fā)生于磷脂表面的抗凝反應(yīng)也產(chǎn)生抑制作用，能夠減緩活化蛋白C 對(duì)活化的凝血因子Ⅴ的滅活，阻礙抗凝血酶與凝血酶形成復(fù)合物，同時(shí)促進(jìn)血小板的激活和活化[6]。因此，狼瘡抗凝物可影響凝血與抗凝反應(yīng)之間的平衡，促進(jìn)體內(nèi)血液高凝，產(chǎn)生了血栓形成的獲得性危險(xiǎn)因素。抗磷脂綜合征的患者由于存在狼瘡抗凝物等抗磷脂抗體的病理作用，從而導(dǎo)致了動(dòng)靜脈血栓及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等臨床表現(xiàn)[7]。

二、狼瘡抗凝物的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

狼瘡抗凝物的檢測(cè)是臨床診斷抗磷脂綜合征的關(guān)鍵[8]。依賴磷脂的凝血試驗(yàn)，如APTT 法和dRVVT 法是國(guó)際上最常用的2 種檢測(cè)方法。狼瘡抗凝物的存在會(huì)導(dǎo)致APTT（內(nèi)源性途徑及共同途徑）和dRVVT（共同途徑）試驗(yàn)中的凝血時(shí)間延長(zhǎng)，因此被廣泛作為狼瘡抗凝物的篩查試驗(yàn)[2,9]。在試驗(yàn)體系內(nèi)添加高濃度磷脂成分以使患者延長(zhǎng)的凝血時(shí)間縮短的確證試驗(yàn)，則是實(shí)驗(yàn)室診斷狼瘡抗凝物的重要環(huán)節(jié)[10]。同時(shí)，為了與凝血因子缺陷所致的APTT延長(zhǎng)相鑒別，特別是先天性凝血因子缺陷造成的凝血時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)行鑒別，通常還需要進(jìn)行混合試驗(yàn)，即將患者血漿與正常人血漿1∶1 混合，觀察延長(zhǎng)的凝血時(shí)間是否可被糾正[3,11]。國(guó)際血栓與止血學(xué)會(huì)在其2009 指南中推薦，狼瘡抗凝物的檢測(cè)順序?yàn)楹Y選試驗(yàn)、混合試驗(yàn)、確證試驗(yàn)；而2014 年CLSI 關(guān)于狼瘡抗凝物檢測(cè)指南——CLSI 2014（H60）文件（以下簡(jiǎn)稱CLSI 指南）則建議檢測(cè)流程為篩選試驗(yàn)、確證試驗(yàn)、混合試驗(yàn)。但在臨床實(shí)踐中，對(duì)混合試驗(yàn)在狼瘡抗凝物診斷中的必要性尚存在爭(zhēng)論[12]。CLSI 指南中明確提出，狼瘡抗凝物的復(fù)合試驗(yàn)應(yīng)包括混合糾正試驗(yàn)，但并非必要，應(yīng)根據(jù)患者已有檢測(cè)結(jié)果和臨床癥狀來(lái)決定是否需要作進(jìn)一步試驗(yàn)以明確診斷[3]。

圖2 dRVVT 標(biāo)準(zhǔn)化比值分別與APTT(病漿)、R1、R2 關(guān)系的散點(diǎn)圖

綜上，本研究結(jié)果顯示，dRVVT 確證試驗(yàn)與混合試驗(yàn)的結(jié)果間具有顯著相關(guān)性，但并非嚴(yán)格的線性相關(guān)?；谠砩系牟顒e，本研究認(rèn)為2 種檢測(cè)方法在狼瘡抗凝物檢測(cè)中仍具有相對(duì)的獨(dú)立性，并不可完全替代。兩者相結(jié)合的復(fù)合實(shí)驗(yàn)可以提高狼瘡抗凝物的陽(yáng)性率和準(zhǔn)確率[13-14]。總之，基于共同途徑dRVVT 法的篩選、確證試驗(yàn)是國(guó)際上檢測(cè)狼瘡抗凝物較常用的方法之一，但對(duì)于弱陽(yáng)性的患者或結(jié)果難以解釋時(shí)，需要結(jié)合混合試驗(yàn)結(jié)果，以幫助鑒別由于凝血因子缺乏及其抗體所造成的APTT檢測(cè)結(jié)果延長(zhǎng)。雖然本研究顯示，確證試驗(yàn)與混合試驗(yàn)結(jié)果間具有較強(qiáng)的相關(guān)性，但在實(shí)驗(yàn)室人力、物力允許的情況下，仍建議將二者相結(jié)合進(jìn)行分析，從而提高狼瘡抗凝物的檢出率，降低誤診率和漏診率。