血清miR-124 miR-145檢測對急性缺血性腦卒中的診斷價值

劉麗嬌 楊秀麗 徐祥輝 秦 毅

1)新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)發(fā)病率約占腦卒中總?cè)藬?shù)的70.0%[1-2]，并隨我國人口老齡化趨勢加劇呈增長態(tài)勢，若未予以及時診治，可觸發(fā)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等一系列缺血級聯(lián)病理事件，誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞凋亡及壞死[3-4]。目前診斷AIS多依賴于卒中量表評分、頭顱CT或磁共振成像(MRI)影像學(xué)手段，但其診斷準(zhǔn)確性均有待提高。近年來隨著基因芯片技術(shù)快速發(fā)展，RNA作為疾病診斷的檢測生物標(biāo)志物已成現(xiàn)實。microRNA(miRNA)具有高組織特異性、相對穩(wěn)定性及體液豐度等特點[5-6]，能通過抑制轉(zhuǎn)錄或降解mRNA，達(dá)到調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄后水平、介導(dǎo)血管生成、凋亡及氧化應(yīng)激的目的，可作為潛在性組織損傷生物標(biāo)志物[7-8]。miR-124是腦組織損傷診斷敏感性的循環(huán)生物標(biāo)志物，在腦部神經(jīng)發(fā)育、調(diào)控中樞神經(jīng)功能中起重要作用[9]。miR-145是影響頸動脈粥樣硬化(CAS)穩(wěn)定性的重要基因，與頸動脈狹窄程度具有一定關(guān)聯(lián)性[10]。但臨床關(guān)于miR-124、miR-145在AIS診斷中的價值尚未完全闡明。本研究以血清miR-124、miR-145為觀察指標(biāo)，探討其對AIS的診斷價值及與CAS斑塊性質(zhì)關(guān)聯(lián)性。

1 資料和方法

1．1一般資料選取2017-07-2019-10新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院收治的AIS患者82例為AIS組，男49例，女33例；年齡47～76(62.34±5.15)歲；體重指數(shù)18.4～26.4(21.96±1.53)kg/m2；根據(jù)美國國立衛(wèi)生院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)輕度(NIHSS評分≤6分)18例，中度(NIHSS評分7～14分)40例，重度(NIHSS評分≥15分)24例；根據(jù)CAS斑塊性質(zhì)分為易損斑塊45例，穩(wěn)定斑塊37例；并發(fā)癥：高血脂12例，高血壓25例，糖尿病8例，冠心病15例；有吸煙史15例。另選同期健康體檢者82例為對照組，男52例，女30例；年齡48～78(61.86±4.93)歲；體重指數(shù)18.1～26.8(22.04±1.62)kg/m2；10例有吸煙史。2組基本資料(年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙史)均衡可比(P>0.05)。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1．2選取標(biāo)準(zhǔn)

1．2．1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合《急性缺血性卒中靜脈溶栓中國卒中學(xué)會科學(xué)聲明》[11]中的AIS相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；②均經(jīng)頭顱CT或MRI等影像學(xué)檢查確診為AIS；③首次發(fā)??；④均于發(fā)病后≤72 h內(nèi)入院；⑤臨床資料完整；⑥患者或家屬知情并簽署承諾書。

1．2．2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急性冠狀動脈綜合征、瓣膜病、心房顫動、動脈炎及周圍血管疾病者；②肝、腎等重要臟器器質(zhì)性病變者；③合并短暫性腦缺血或腦出血疾病者；④全身感染性疾病者；⑤心源性栓塞型、小動脈閉塞型、其他病因型及不明原因型所致AIS者；⑥近期有免疫抑制劑治療史者；⑦伴有惡性貧血、血液性疾病、甲狀腺功能減退或亢進(jìn)者；(8)精神行為異常者。

1．3方法采集肘靜脈血10 mL，4 ℃條件下3 000 r/min，離心10 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存待測。(1)RNA提取：按照mirVana PARIS試劑盒(購自美國ABI公司)說明書分離總RNA。通過RNase Free水洗滌，收集總RNA(100 μl)，同時應(yīng)用NanoDrop ND-1000核酸定量檢測儀(購自美國NanoDrop公司)對RNA濃度、純度進(jìn)行檢測。(2)實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)：引物購自美國MRC Gene公司，根據(jù)miScript SYBR Green Kit試劑盒說明書(美國Ambion公司)進(jìn)行配制反應(yīng)混合物，每個反應(yīng)體系為20 μL，使用熒光定量PCR儀(型號LightCy-cler480：購自瑞士羅氏公司)檢測。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，重復(fù)40個循環(huán)實施擴(kuò)增反應(yīng)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s制備溶解曲線。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在圖像處理系統(tǒng)上分析、計算，得出miR-124、miR-145，GAPDH的光密度，以GAPDH的光密度為參照，求出miR-124、miR-145光密度的變化值(ΔCt)，以2-Ct得到miR-124、miR-145相對表達(dá)量。每個反應(yīng)重復(fù)3次。

1．4觀察指標(biāo)(1)對比2組血清miR-124、miR-145水平。(2)對比不同神經(jīng)缺損程度患者血清miR-124、miR-145水平。(3)采用Logistic多因素回歸分析AIS發(fā)病影響因素。(4)采用受試者工作特征曲線(ROC)分析血清miR-124、miR-145診斷AIS的價值。(5)對比不同CAS斑塊性質(zhì)患者血清miR-124、miR-145水平。(6)采用Pearson線性相關(guān)性分析血清miR-124、miR-145水平與神經(jīng)功能缺損程度、CAS斑塊性質(zhì)關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果

2．1組血清miR-124、miR-145水平比較由表1可知，AIS組血清miR-124水平低于對照組，miR-145水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

組別nmiR124miR145AIS組822.68±0.898.04±2.62對照組823.89±0.735.28±1.59t值9.5198.155P值<0.001<0.001

2．2不同神經(jīng)缺損程度患者血清miR-124、miR-145水平比較由表2可知，隨神經(jīng)功能缺損程度的加重，血清miR-124明顯降低，血清miR-145水平明顯增高(P<0.05)。

表2 不同神經(jīng)缺損程度患者血清miR-124、miR-145 水平比較Table 2 Serum miR-124 and miR-145 levels in patients withdifferent degrees of neurological

2．3 AIS發(fā)病影響因素由表3可知，以是否發(fā)生AIS為因變量，將受試者年齡、性別、體質(zhì)量與血清miR-124、miR-145為自變量實施Logistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清miR-124、miR-145為AIS發(fā)病的重要影響因素(P<0.05)。

2．4診斷價值由表4、圖1可知，經(jīng)ROC曲線分析，血清miR-145診斷AIS的AUC(0.791)>miR-124(0.717)，以7.25為截斷值時，敏感度為64.63%、特異度為90.24%。

2．5不同CAS斑塊性質(zhì)患者血清指標(biāo)水平比較易損斑塊患者血清miR-124低于穩(wěn)定斑塊患者，血清miR-145水平高于穩(wěn)定斑塊患者(P<0.05)。見表5。

表3 AIS發(fā)病影響因素的Logistic回歸分析結(jié)果Table 3 Logistic Regression Analysis Results of AISInfluencing Factors

表4 血清指標(biāo)診斷AIS的ROC曲線Table 4 ROC curve of serum index for diagnosis of AIS

組別nmiR124miR145易損斑塊患者452.36±0.788.72±2.79穩(wěn)定斑塊患者373.07±1.027.21±2.48t值3.5712.563P值0.0010.012

圖1 ROC曲線Figure 1 ROC curve

2．6血清指標(biāo)與神經(jīng)功能缺損程度、CAS斑塊性質(zhì)關(guān)聯(lián)性由表6、圖2、圖3可知，Pearson線性相關(guān)性分析可知，血清miR-124水平與神經(jīng)功能缺損程度、CAS斑塊性質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)，血清miR-145水平與神經(jīng)功能缺損程度、CAS斑塊性質(zhì)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表6 血清指標(biāo)與神經(jīng)功能缺損程度、CAS斑塊性質(zhì)關(guān)聯(lián)性 (n=82)Table 6 Correlation of serum indicators with neurologicaldeficits and CAS plaque properties (n=82)

3 討論

數(shù)據(jù)顯示，>70.0%AIS患者是由頸動脈血管粥樣硬化所致[12-13]。同時相關(guān)研究指出，miRNA通過平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移、炎性反應(yīng)及泡沫細(xì)胞形成等多個過程調(diào)控CAS的發(fā)生發(fā)展[14-16]。因此動態(tài)監(jiān)測相關(guān)miRNA水平變化，對評估AIS病情程度、識別頸動脈血管粥樣硬化斑塊性質(zhì)具有重要作用。

miR-124作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最豐富的miRNA，能夠促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2表型，從而避免神經(jīng)元損傷[17-18]。LIU等[19]研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-124水平在AIS患者中呈異常低表達(dá)狀態(tài)，與本研究觀點一致。研究[20]也證實，體外miR-124有助于促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)，顯著增加M2表型的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，減輕神經(jīng)炎癥，且還能通過降解RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子，抑制神經(jīng)元凋亡，減少缺血性腦損傷、功能障礙，增強神經(jīng)血管重塑[21]，充分證實血清miR-124水平下調(diào)可能是導(dǎo)致AIS的風(fēng)險因素之一。另外，JI等[22]認(rèn)為，AIS患者血漿miR-124水平與梗死體積、NIHSS評分均具有正相關(guān)關(guān)系。同時通過大腦中動脈閉塞小鼠模型還發(fā)現(xiàn)[24]，抑制miR-124表達(dá)夠能顯著增加模型小鼠的梗死體積，小鼠顱內(nèi)注射miR-124擬似物脂質(zhì)體后，腦梗死面積明顯縮小，AIS患者神經(jīng)功能缺損得到顯著緩解。進(jìn)一步經(jīng)Logistic多因素回歸分析、Pearson線性相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-124水平是AIS患者的保護(hù)因素，與神經(jīng)功能缺損程度、CAS斑塊性質(zhì)存在明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，與上述研究相符，充分證明miR-124低表達(dá)可能加重AIS患者神經(jīng)功能缺損，增加CAS斑塊破裂的風(fēng)險性。

miR-145主要存在于血管平滑肌內(nèi)，在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要作用，其水平上調(diào)，可引發(fā)血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡紊亂，加重血管損傷。本研究對比2組血清miR-145水平可知，血清miR-145水平在AIS患者中出現(xiàn)異常高表達(dá)狀態(tài)，并隨神經(jīng)缺損嚴(yán)重程度呈升高趨勢，充分說明血清miR-145表達(dá)水平上調(diào)，可調(diào)控CD40L表達(dá)，釋放大量血管內(nèi)炎癥因子，加重血管炎癥反應(yīng)，進(jìn)而在AIS發(fā)生、發(fā)展中起促進(jìn)作用，且miR-145水平高表達(dá)還能降低超氧化物歧化酶活性，參與腦缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激過程，加重神經(jīng)功能損傷程度。ROC曲線分析進(jìn)一步證明，血清miR-145診斷AIS的AUC(0.791)>miR-124(0.717)，且當(dāng)截斷值為7.25時，特異度高達(dá)90.24%，說明miR-145有望成為診斷AIS的特異性生物標(biāo)志物，為臨床早期AIS診治提供新思路、新方向。另外，有學(xué)者指出，在缺氧條件下，miR-145表達(dá)下調(diào)是導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞過度增殖、遷移，加重血管損傷后再狹窄程度，促進(jìn)血管狹窄發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。通過RT-PCR法檢測不同CAS斑塊性質(zhì)患者可知，易損斑塊患者血清miR-145水平明顯高于穩(wěn)定斑塊患者，提示miR-145可能是識別CAS斑塊性質(zhì)的潛在標(biāo)志物，故可通過調(diào)節(jié)血清miR-145水平，防止CAS斑塊破裂，促進(jìn)AIS病情轉(zhuǎn)歸。

血清miR-124、miR-145作為診斷AIS的潛在特異性生物標(biāo)志物，與神經(jīng)功能缺損程度、CAS斑塊性質(zhì)存在一定相關(guān)性，在AIS患者治療過程中可通過調(diào)節(jié)血清miR-124、miR-145表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)功能、抑制CAS斑塊病變進(jìn)展的作用。