基于液滴界面不穩(wěn)定性的表面粗糙聚合物微球的制備及其細(xì)胞捕獲應(yīng)用*

王月桐 商珞然 趙遠(yuǎn)錦?

1)(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210096)

2)(復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院,復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院徐匯醫(yī)院,上海 200032)

具有不同組成和形態(tài)的聚合物顆粒近來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注,它們的表面粗糙度顯著影響著其理化性能,尤其在調(diào)節(jié)生物材料與生物系統(tǒng)間的相互作用中發(fā)揮著重要作用.本文設(shè)計(jì)了一種具有表面可調(diào)褶皺結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯微球.首先通過(guò)微流控裝置產(chǎn)生尺寸均一的含有疏水聚合物和助表面活性劑的液滴.在有機(jī)溶劑的揮發(fā)過(guò)程中,不斷收縮的液滴出現(xiàn)界面不穩(wěn)定現(xiàn)象.表面面積自發(fā)增大,固化后得到表面具有褶皺的微球.研究結(jié)果表明,調(diào)節(jié)助表面活性劑的濃度以及溶劑揮發(fā)速率均可以有效調(diào)控微球表面粗糙程度.循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)表明,這種褶皺結(jié)構(gòu)能明顯增強(qiáng)細(xì)胞黏附力,提高細(xì)胞捕獲量.以上這些特征表明這種表面褶皺微球?qū)⒃谏镝t(yī)學(xué)分析領(lǐng)域具備良好的應(yīng)用前景.

1 引 言

具有不同組成和形態(tài)的聚合物顆粒近來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注.基于高分子材料的理化特性利用各種加工方法可以制備出不同尺寸和結(jié)構(gòu)的聚合物微粒,例如光滑微球、表面粗糙微球、多孔微球、片狀微粒、紅細(xì)胞狀微球等[1,2].它們的光學(xué)、電化學(xué)性質(zhì)等可以通過(guò)結(jié)構(gòu)、尺寸和組成進(jìn)行調(diào)節(jié),從而在生物材料、藥理學(xué)、化工等領(lǐng)域有重要應(yīng)用[3?5].各向異性的表面微結(jié)構(gòu)是這類(lèi)聚合物顆粒最突出的特征之一.表面形貌顯著影響其理化性能,例如催化性能和效率、自組裝結(jié)構(gòu)、血小板黏附特性、生物化學(xué)反應(yīng)程度等[6,7].更有趣的是,表面粗糙的粒子在調(diào)節(jié)生物材料和生物體系之間的相互作用方面起著至關(guān)重要的作用.具有表面粗糙結(jié)構(gòu)的微粒由于與某些具有特殊形狀和表面結(jié)構(gòu)的細(xì)胞及微生物在結(jié)構(gòu)上有相似之處,所以會(huì)對(duì)細(xì)胞的黏附、遷移、增長(zhǎng)和組織愈合等進(jìn)行調(diào)控從而行使特定的生物學(xué)功能[8,9].因此,調(diào)控粒子的表面微觀結(jié)構(gòu)在設(shè)計(jì)功能性生物材料方面提供了新的思路.

目前,有很多方法可以制備聚合物微球,主要有聚合法(如乳液聚合、懸浮聚合、沉淀聚合)、乳液-溶劑揮發(fā)法(如相分離、界面失穩(wěn))、微加工法(如軟印刷、微流控技術(shù))等[10?12].通過(guò)調(diào)控實(shí)驗(yàn)參數(shù),可以得到各種尺寸、形狀可調(diào)的微粒.通常,由于在顆粒和介質(zhì)之間的界面自由能趨于最小化,在異相體系(例如乳液、懸浮液和分散液等)中聚合制備的聚合物顆粒具有球形形貌[13,14].對(duì)于如何突破球形界面的限制產(chǎn)生表面粗糙的聚合物微粒這一問(wèn)題,研究人員已經(jīng)做了許多嘗試.其中,通過(guò)引入表面活性劑可以對(duì)乳液液滴界面現(xiàn)象進(jìn)行調(diào)節(jié).表面活性劑是一類(lèi)兩親性物質(zhì),在乳液界面起到降低界面張力的作用,從而維持乳液穩(wěn)定存在[15,16].在溶劑揮發(fā)過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致界面曲率增加、界面面積減小、表面活性劑濃度增加等一系列變化.當(dāng)乳液液滴界面張力不斷降低至一定程度會(huì)導(dǎo)致界面面積自發(fā)增大,從而使界面發(fā)生擾動(dòng),這種現(xiàn)象稱(chēng)之為乳液液滴界面不穩(wěn)定[17,18].利用此機(jī)制制備具有復(fù)雜表面微結(jié)構(gòu)的聚合物微球操作簡(jiǎn)單、可調(diào)控性強(qiáng)、各向異性明顯;但由于常規(guī)的攪拌等方法制備的乳液液滴單分散性較差,因此常常導(dǎo)致生成的微球尺寸差異較大,且該方法僅局限于兩親性嵌段共聚物的體系,而對(duì)于疏水性聚合物(均聚物或者共聚物)鮮有報(bào)道,這限制了該方法的適用范圍.微流控方法可以較好地解決乳液的單分散性問(wèn)題,微流控技術(shù)是指在微尺度(幾十至幾百微米)范圍下對(duì)微量流體(10–9— 10–18L)進(jìn)行系統(tǒng)地整合和操控的技術(shù)[19?21].在材料制備方面,微流控技術(shù)舉足輕重.通過(guò)多樣化的材料選擇和精巧的流體通道設(shè)計(jì),可以對(duì)所生成的材料的形貌以及結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確的控制,因此其在復(fù)雜形貌及多功能材料制備方面顯示出巨大的應(yīng)用前景[22,23].基于微流控技術(shù)制備的微粒具有粒徑均一、尺寸可控、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、應(yīng)用廣泛等明顯優(yōu)勢(shì),但其缺點(diǎn)是需要與其他技術(shù)相結(jié)合才能對(duì)聚合物微粒的復(fù)雜結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控.因此,利用微流控技術(shù)大量生產(chǎn)具有可控表面粗糙度的功能化聚合物顆粒仍然是一個(gè)較大的挑戰(zhàn).

本文將微流控技術(shù)與液滴界面不穩(wěn)定機(jī)制相結(jié)合,構(gòu)建了尺寸均一、表面粗糙結(jié)構(gòu)可調(diào)的聚苯乙烯微球.如圖1所示,首先基于毛細(xì)管微流控芯片制備出單分散的水包油乳液液滴,進(jìn)而研究了疏水的均聚物聚苯乙烯(Polystyrene,PS)在表面活性劑十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和助表面活性劑n-十六烷醇(n-hexadecanol,HD)的共同作用下使乳液液滴發(fā)生的界面不穩(wěn)定的過(guò)程.接著,通過(guò)調(diào)控溶劑揮發(fā)速率及助表面活性劑的濃度等實(shí)驗(yàn)參數(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)微球表面粗糙度的調(diào)控.由于可操控表面微結(jié)構(gòu)微球在細(xì)胞培養(yǎng)、捕獲等方面具有的良好應(yīng)用前景,我們將制備得到的微球用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTC)的捕獲研究,考察其對(duì)提高捕獲效率的作用效果.

圖1 表面粗糙聚苯乙烯微球的制備示意圖(a)均勻乳液液滴的微流控生成示意圖;(b)具有表面褶皺的固體微球的形成過(guò)程示意圖,在收集皿中,液滴內(nèi)氯仿的揮發(fā)觸發(fā)了界面不穩(wěn)定性現(xiàn)象,隨之產(chǎn)生表面的褶皺Fig.1.Schematic illustration of the fabrication of polystyrene microspheres with rough surface:(a)Schematic representation of generating uniform emulsion droplets from microfluidic devices;(b)schematic diagram of the formation process of solidified microspheres with surface wrinkles.In the collection dish,the volatilization of chloroform from droplets triggers the interface instability phenomenon,then the surface wrinkles are generated.

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 微流控芯片制備乳液液滴

本實(shí)驗(yàn)中首先通過(guò)玻璃毛細(xì)管微流控裝置制備單乳液液滴模版,玻璃毛細(xì)管的組裝按照典型的協(xié)流式單乳液通道結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行.分散相(內(nèi)相)溶液由10 mg/mL的聚苯乙烯/ 氯仿溶液、不同濃度的n-十六烷醇/氯仿溶液組成;連續(xù)相(外相)溶液由3 mg/mL的SDS/甘油溶液組成,選擇十二烷基硫酸鈉固體粉末,溶于30 vol.%甘油/水溶液中;收集液的組分同連續(xù)相溶液.

為產(chǎn)生單分散性的水包油乳液液滴,將一定量的內(nèi)外相溶液抽取到不同規(guī)格的玻璃注射器中并將其分別安放在蠕動(dòng)泵上,設(shè)定內(nèi)外相流速,啟動(dòng)蠕動(dòng)泵工作.通過(guò)改變內(nèi)外相流速對(duì)生成乳液液滴的尺寸和產(chǎn)率進(jìn)行調(diào)控.

2.2 表面褶皺聚苯乙烯微球的生成與調(diào)控

將上述生成的液滴收集在不同體積的SDS/甘油溶液中,可在顯微鏡下觀察到隨著有機(jī)溶劑在水相中的擴(kuò)散、蒸發(fā),乳液液滴界面不穩(wěn)定現(xiàn)象被觸發(fā),液滴逐漸固化并在表層形成不同程度的褶皺.懸浮在溶液中的微粒首先在去離子水中透析7天以去除表面的甘油、SDS和殘余的氯仿,然后在乙醇中透析7天以去除HD.

微球表面褶皺程度的調(diào)控可主要從以下兩個(gè)因素的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn): 1)在 0—3 mg/mL 范圍內(nèi)改變分散相中HD的濃度,可得到從表面平滑到高度褶皺的聚合物微粒;2)在 0.5 —10.0 mm 范圍內(nèi)改變收集液SDS/甘油溶液的高度,從而影響有機(jī)溶劑的蒸發(fā)速率,造成表面形態(tài)變化.為了使微球適應(yīng)于更廣泛應(yīng)用的功能,將上述具有褶皺結(jié)構(gòu)的微球浸泡在四氧化三鐵納米粒子分散液中并保持3 h震蕩.由于吸附有磁性納米粒子的聚苯乙烯微球在水中的沉降速度較快,因此采用靜置法使微球沉至底部,移除上方溶液后添加超純水多次洗滌.洗滌完全后,可通過(guò)外加磁鐵實(shí)現(xiàn)微球的快速分離.

2.3 褶皺微球用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)捕獲實(shí)驗(yàn)

將干燥的聚苯乙烯褶皺微球樣品放入真空等離子清洗機(jī)反應(yīng)腔內(nèi),等離子體處理5 min,使其惰性的表面活化,便于后續(xù)抗體的接枝和特異性固定.由于在等離子體處理過(guò)程中需要開(kāi)啟真空泵,這可能會(huì)導(dǎo)致一部分磁性粒子的損耗,但通過(guò)增加磁性納米粒子的初始吸附數(shù)量、合理控制等離子體處理時(shí)間等措施,能夠減弱這種損耗對(duì)整個(gè)褶皺微球磁性的影響.接著,將抗上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)特異性抗體穩(wěn)定、均一地修飾在聚苯乙烯微球表面.隨后,采用外周血 MCF-7 腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞,將褶皺微球添加到MCF-7細(xì)胞懸液中.為了便于觀察和計(jì)數(shù),細(xì)胞通過(guò)鈣黃綠素染色.

3 結(jié)果與討論

微流控通道內(nèi)液滴的生成是在流場(chǎng)作用下流體界面發(fā)生形變導(dǎo)致的界面不穩(wěn)定性增強(qiáng)的結(jié)果.無(wú)論是協(xié)流式、T形,還是流動(dòng)聚焦式通道,當(dāng)分散相和連續(xù)相流體相遇時(shí),分散相流體被拉伸.最終,在自由表面失穩(wěn)條件下,分散相流體斷裂而形成液滴,如圖 2(a)所示.通常來(lái)講,液滴的斷裂是黏性力和界面張力相抗衡的結(jié)果,前者使界面發(fā)生形變而后者抵抗形變.另外,液滴在斷裂時(shí)對(duì)交叉口的阻隔作用會(huì)產(chǎn)生一個(gè)瞬時(shí)增強(qiáng)的上游壓力,從而帶動(dòng)下一個(gè)液滴的斷裂.此外,通道的浸潤(rùn)性也會(huì)影響液滴的生成,因?yàn)楫?dāng)連續(xù)相流體能夠優(yōu)先浸潤(rùn)通道內(nèi)壁時(shí),連續(xù)相流體會(huì)在內(nèi)壁上形成薄膜,從而阻止分散相流體與管壁的直接接觸,這樣就可以避免三相接觸線對(duì)整個(gè)體系的影響.因此在本工作中,通過(guò)選擇合理的通道尺寸、流速條件,以及對(duì)連續(xù)相流體通道進(jìn)行疏水修飾,保證了液滴能夠穩(wěn)定地生成.如圖2(b)所示,體式顯微鏡下觀察收集到的乳液液滴直徑在300 μm左右,尺寸均一,分散度比較好.通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)外相流速能夠?qū)ι扇橐阂旱蔚某叽绾彤a(chǎn)率進(jìn)行調(diào)控,如圖2(d)和圖2(e),內(nèi)相流速越小,外相流速越大,液滴尺寸越小,相應(yīng)的間隔越大,即生成液滴越稀疏,產(chǎn)率變低.

將液滴收集在含有外相溶液的玻璃皿中,可以明顯觀察到隨著氯仿的蒸發(fā),乳液液滴不斷縮小,同時(shí)產(chǎn)生“漣漪狀”物質(zhì),最后聚苯乙烯團(tuán)聚成微球的形狀,呈現(xiàn)黑色,通過(guò)光學(xué)顯微鏡追蹤此過(guò)程如圖3所示.在有機(jī)溶劑氯仿的揮發(fā)過(guò)程中,乳液液滴變小導(dǎo)致了界面曲率增加、界面面積減小、表面活性劑濃度增加等一系列物理變化.當(dāng)界面張力降低到一定程度時(shí),液滴表面面積自發(fā)增大(類(lèi)似于花朵綻放的過(guò)程),即觸發(fā)了乳液液滴界面不穩(wěn)定機(jī)制.另外,在氯仿?lián)]發(fā)過(guò)程中,PS 與 HD 之間因?yàn)榛ゲ幌嗳芏l(fā)生相分離,形成非常微小的液滴.隨著整個(gè)乳液液滴體積收縮,微小液滴逐漸融合,PS微球慢慢固化過(guò)程中小液滴占據(jù)的位置成為凹陷孔隙,進(jìn)一步增加了微球表面的粗糙度.待氯仿徹底揮發(fā)后,該結(jié)構(gòu)被固定,最終得到表面具有凹陷孔隙分布和均勻凸出褶皺結(jié)構(gòu)的微球.由于液滴是基于微流控芯片產(chǎn)生的,具有均一的尺寸分布,因此同等條件下經(jīng)過(guò)氯仿?lián)]發(fā)后的固化微球也具有較為良好的單分散性,微球直徑在80 μm左右,如圖2(c)所示.

圖2 (a)微流控通道內(nèi)液滴的實(shí)時(shí)生成圖像,比例尺為 600 μm;(b),(c)液滴及其相應(yīng) PS 微球的光鏡圖片,比例尺分別為 200和80 μm;(d),(e)液滴直徑和內(nèi)外相流速之間的曲線關(guān)系圖:(d)當(dāng)內(nèi)相流速保持在 0.1 mL/h 不變時(shí),液滴直徑與外相流速間呈負(fù)相關(guān);(e)當(dāng)外相流速保持在5 mL/h不變時(shí),直徑與內(nèi)相流速呈正相關(guān)Fig.2.(a)Real-time images of droplets generated in the microfluidic device,the scale bar is 600 μm;(b),(c)microscope photographs of the(b)droplets and(c)the resultant PS microparticles.The scale bars are 200 μm in(b)and 80 μm in(c),respectively;(d),(e)Relationships of the droplets radius with(d)the same inner flow rate and(e)the same outer flow rate,respectively.Error bars represent standard deviations.

圖3 體式顯微鏡下觀察到的具有褶皺表面的微球的生成過(guò)程.隨?著氯仿的蒸發(fā),乳液液滴不斷縮?小,同時(shí)產(chǎn)生“漣漪狀”物質(zhì),最后 PS 玻璃化形成固化微球,此過(guò)程在常溫下約持續(xù) 1 min.圖(a)(f)的比例尺為 300 μm,圖(g)(i)的比例尺為 250 μmFig.3.Formation process of microspheres with wrinkled surface observed under the microscope.With the evaporation of chloroform,the droplets continue to shrink,and meanwhile,the "ripple-like" substance is produced.Finally,the PS vitrifies to form solidified microspheres.This process lasts about 1 minute at the room temperature.The scale bars are 300 μm in(a)?(f)and 250 μm in(g)?(i),respectively.

我們探究了內(nèi)相溶液中HD的濃度和收集液高度這兩個(gè)主要因素對(duì)微球表面褶皺度的影響.當(dāng)HD的濃度從0逐步增加到3 mg/mL時(shí),微球表面褶皺度發(fā)生了明顯的變化.內(nèi)相溶液中不含HD,即濃度為 0 mg/mL 時(shí),所得微球表面非常平滑,幾乎沒(méi)有褶皺,其光鏡和電鏡的表征圖像如圖4(a)和圖 4(d)所示.當(dāng) HD濃度提高到 0.5 mg/mL時(shí)表面出現(xiàn)局部不平滑的區(qū)域(圖4(b)和圖4(e)),具體表現(xiàn)為微球表面形成了凹陷孔隙的分布.如圖 4(c),圖 4(f)—圖 4(h),圖 4(j),和圖 4(k)顯示,從 1 mg/mL開(kāi)始微球表面出現(xiàn)均勻褶皺,在1—3 mg/mL 之間,隨著 HD 濃度的增加,微球表面伸出的粗糙結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度不斷增加.當(dāng)濃度達(dá)到3 mg/mL 時(shí),球體核心變得非常小,被大幅度褶皺覆蓋.助表面活性劑HD的濃度對(duì)表面形貌的影響可歸結(jié)于HD分子在油/水交界面處的累積和重排,且進(jìn)一步滲透到SDS單層中誘導(dǎo)SDS的組裝,兩個(gè)過(guò)程都共同導(dǎo)致了乳液液滴界面張力的降低,從而引起界面不穩(wěn)定現(xiàn)象的發(fā)生,產(chǎn)生了伸展出表面的褶皺.

圖4 具有不同表面褶皺度的聚苯乙烯微球的光鏡和電鏡表征.這些微球是由含有相同濃度PS和不同濃度HD的液滴模板固化得到,其對(duì)應(yīng)的 HD 濃度如下?:(a),(d?)0 mg/mL;(b),(e)0.5? mg/mL;?(c),(f)1 mg/mL;(g),(j)1.5 mg/mL;(h),(k)2 mg/mL;(i),(l)3 mg/mL.光鏡圖片((a)(c),(g)(i))和電鏡圖片((d)(f),(j)(l))的比例尺分別為 45和30 μmFig.4.The optical microscopy and SEM images of the PS microparticles with different surface-roughness.They are obtained from microfluidic droplet templates containing 10 mg/mL PS and varied concentrations of HD:(a),(d)c=0 mg/mL;(b),(e)c=0.5 mg/mL;(c),(f)c=1 mg/mL;(g),(j)c=1.5 mg/mL;(h),(k)c=2 mg/mL;and(i),(l)c=3 mg/mL.The scale bars are 45 μm in((a)?(c),(g)?(i))and 30 μm in((d)?(f),(j)?(l)),respectively.

另外,當(dāng)收集液 SDS/甘油的液面高度在0.5—10.0 mm 范圍內(nèi)變化時(shí),保持容器底面直徑固定,隨著收集液體積增加,褶皺度逐漸降低,這與HD的濃度變化的影響相反.由此可見(jiàn),水層高度明顯影響有機(jī)溶劑的揮發(fā)速率,從而可以通過(guò)調(diào)節(jié)揮發(fā)速率的快慢制備各種形態(tài)的聚合物粗糙微球.綜合來(lái)看,乳液液滴揮發(fā)觸發(fā)的界面失穩(wěn)過(guò)程和液滴的相變是兩個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性的過(guò)程,當(dāng)溶劑揮發(fā)非?？鞎r(shí),乳液液滴中的界面張力降低占主導(dǎo)作用,首先發(fā)生了界面不穩(wěn)定現(xiàn)象,然后固化形成粗糙微球;當(dāng)溶劑揮發(fā)非常慢時(shí),液滴在沒(méi)有達(dá)到很低的界面張力時(shí)就已經(jīng)固化,形成了較光滑的微球.

由于微球表面褶皺之間的間隙較小,磁性納米粒子能夠被吸附在間隙中并保持穩(wěn)定.宏觀磁吸實(shí)驗(yàn)可以證明,微球整體可以在磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行可控運(yùn)動(dòng).將一批表面載有磁性納米粒子的褶皺微球裝在透明玻璃瓶?jī)?nèi),在永磁鐵的作用下,可以觀察到微球被吸引到靠近磁鐵的瓶壁一側(cè),如圖5所示.因此可以證明,所制備的微球具有磁控運(yùn)動(dòng)特性,這為后續(xù)的細(xì)胞捕獲和富集帶來(lái)了極大便利.

圖5 表面包覆有四氧化三鐵納米粒子的聚苯乙烯褶皺微球被賦予較強(qiáng)的磁響應(yīng)性.在永磁鐵的引導(dǎo)下,微球被吸引到靠近磁鐵的瓶壁一側(cè).圖中比例尺為1.5 cmFig.5.Strong mangnetic responsiveness of the highly textured PS microparticles coated with Fe3O4 nanoparticles.Under the guidance of the permanent magnet,the microspheres are attracted to the side of the bottle wall near the magnet.The scale bar is 1.5 cm.

圖6 被捕獲在微球表面的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像(a)橫截面熒光圖像;(b)明場(chǎng)圖像;(c)(a)和(b)合并后的圖像;(d)細(xì)胞捕獲數(shù)量與微球表面褶皺度的關(guān)系Fig.6.The CLSM images of CTC captured onto the surface of the PS microparticles:(a)The cross-section fluorescent images;(b)the white-light images,and(c)the merged images.The scale bar is 30 μm;(d)the relationships of the number of captured cells with the extents of surface wrinkles.

由于粗糙表面有利于細(xì)胞黏附、傳播和生長(zhǎng),我們探究了這種表面褶皺微球的腫瘤循環(huán)細(xì)胞捕獲應(yīng)用.長(zhǎng)期以來(lái),臨床在癌癥的診斷與治療中,通常是利用組織細(xì)胞活檢來(lái)進(jìn)行確診并跟蹤治療效果,這種方法不僅會(huì)給患者帶來(lái)身體上的創(chuàng)傷,而且價(jià)格昂貴.診斷癌癥更好的方法是對(duì)游離在血液中的腫瘤細(xì)胞,即循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè).CTC被認(rèn)為是癌癥轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素,但是它在血液循環(huán)系統(tǒng)中的含量極少,一般 1 mL 血液中只有 1—10 個(gè),因此急需高效的捕獲和富集載體[24,25].我們將表面修飾特異性抗體的褶皺微球加入到細(xì)胞懸液中并進(jìn)行染色觀察,如圖6(a)—圖6(c),共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)圖像顯示鈣黃綠素染色的MCF-7細(xì)胞附著在褶皺表面,且發(fā)出明亮的綠色熒光.為了獲得更高的捕獲效率,我們還探索了細(xì)胞數(shù)量與褶皺程度之間的關(guān)系.為此,將具有相同濃度抗體,但褶皺度不同的微球與相同濃度的細(xì)胞一起孵育,根據(jù)CLSM圖像計(jì)算并分析捕獲的細(xì)胞.圖6(d)顯示在光滑聚苯乙烯微球表面捕獲的細(xì)胞數(shù)量較少,而隨著褶皺程度的增加,被捕獲的數(shù)量相應(yīng)增多.

4 結(jié) 論

提出了一種具有表面粗糙微結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯微球的可控制備方法.采用微流控技術(shù)制備出單分散的乳液液滴,原位觀測(cè)乳液液滴的界面不穩(wěn)定現(xiàn)象及微球的形成過(guò)程,并對(duì)其形成機(jī)制進(jìn)行了分析,提出了界面不穩(wěn)定現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)理.表面活性劑SDS及助表面活性劑HD的加入使得溶劑揮發(fā)過(guò)程中界面張力降低而觸發(fā)乳液液滴界面不穩(wěn)定,最終得到表面粗糙結(jié)構(gòu)的聚合物微球.改變HD的濃度以及有機(jī)溶劑的揮發(fā)速率可以有效調(diào)控微球表面的粗糙程度.制備的粗糙微球還可以吸附磁性納米粒子、包覆熒光染料等,且其粗糙褶皺結(jié)構(gòu)有利于增加與細(xì)胞間的黏附作用,因此我們進(jìn)一步探究了微球在捕獲外周血中CTC的作用效果.我們發(fā)現(xiàn),微球捕獲富集細(xì)胞的能力與其表面褶皺程度呈現(xiàn)正相關(guān),因此能夠通過(guò)調(diào)控粗糙度實(shí)現(xiàn)CTC捕獲效率的精確控制.此外,這種用于制備具有高度褶皺表面顆粒的通用方法還可以擴(kuò)展到其他類(lèi)型的疏水性聚合物,其將在藥物遞送、生化分析、組織工程、催化涂覆和裝置制造領(lǐng)域中有重要的潛在應(yīng)用.