豫西黑豬線粒體COXI基因的擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)生分析

周武 楊又兵 王陽陽 王麗 徐碩輝 邢沛 和俊豪 卞軍平 龐有志

摘要? ? 豫西黑豬作為一個(gè)極具發(fā)展?jié)摿Φ牡胤狡贩N，其種質(zhì)資源面臨著基因混雜的風(fēng)險(xiǎn)。通過對(duì)豫西黑豬的線粒體COXI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，并與其他22種不同豬種的COXI基因進(jìn)行序列比對(duì)，采用最大似然法（ML法）和鄰接法（NJ法）建立系統(tǒng)發(fā)育樹，探究其與其他豬種之間的遺傳變異及種系發(fā)育關(guān)系。結(jié)果表明，23個(gè)豬種該基因序列保守位點(diǎn)和變異位點(diǎn)分別占總位點(diǎn)的96.5%和3.5%，不同豬種間線粒體COXI基因的相似度均在96.5%以上。豫西黑豬線粒體COXI基因表現(xiàn)出明顯A、T堿基偏好性。系統(tǒng)發(fā)育樹和遺傳距離結(jié)果顯示，豫西黑豬種內(nèi)遺傳距離較近，并且與杜洛克豬的遺傳距離較近，說明豫西黑豬與杜洛克豬之間存在基因混雜情況。

關(guān)鍵詞? ? 豫西黑豬;線粒體;COXI基因;NJ樹;ML樹

中圖分類號(hào)? ? S828.8+9? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）07-0211-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

豫西黑豬是河南西部地區(qū)的一個(gè)重要且極具發(fā)展?jié)摿Φ奶厣i種，具有肉質(zhì)鮮美、風(fēng)味獨(dú)特、抗應(yīng)激、耐粗飼等優(yōu)良特性[1]，但由于外來洋豬種的不斷引進(jìn)、實(shí)際生產(chǎn)過程中操作不規(guī)范、防疫水平低等原因，致使黑豬的優(yōu)良特性發(fā)揮極不充分，瀕臨滅絕，其保種復(fù)壯工作的開展刻不容緩。

線粒體是一種獨(dú)立且存在于細(xì)胞核之外的有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，其內(nèi)部擁有不同于細(xì)胞核遺傳物質(zhì)的信息量，而且其形態(tài)結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，常被用作分子標(biāo)記，為生物的遺傳、進(jìn)化、疾病治療等研究提供了大量分子學(xué)依據(jù)[2]。COXI基因則是線粒體DNA的重要組成部分，它具有進(jìn)化速度快、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、母系遺傳等特點(diǎn)，常被作為分子標(biāo)記來比較生物體種內(nèi)或種間進(jìn)化變異的相互關(guān)系，現(xiàn)在寄生蟲、靈長類動(dòng)物的分子進(jìn)化規(guī)律及血緣關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育的研究中大量應(yīng)用此技術(shù)[3]，但目前基于COXI基因?qū)τ谠ノ骱谪i的研究還較少。

本研究通過對(duì)豫西黑豬的線粒體COXI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，并與其他22個(gè)不同豬種的COXI基因進(jìn)行序列比對(duì)，采用MEGA 7.0軟件應(yīng)用鄰接法（NJ法）和最大似然法（ML法）建立系統(tǒng)發(fā)育樹，探究豫西黑豬與其他不同豬種之間的遺傳變異關(guān)系，以期為豫西黑豬種質(zhì)資源的保護(hù)提供科學(xué)有效的理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

本研究采集豫西黑豬和商品白豬血液樣本各15個(gè)，血液樣本的采集方法是前腔靜脈采血[4]。

1.2? ? 豫西黑豬線粒體DNA COXI基因引物合成

其他豬種的COXI基因序列來自NCBI數(shù)據(jù)庫中Gen Bank，利用Premier 5.0軟件對(duì)豫西黑豬的COXI基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[5]，上游引物F的序列為5-ACTACTTCCACCATCCT

T-3;下游引物R的序列為5-CCTATAATGGCGAACACT-3，退火溫度為48 ℃，引物基因擴(kuò)增長度為864 bp，該基因的合成工作由上海生工公司完成。

1.3? ? PCR擴(kuò)增技術(shù)

利用全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，擴(kuò)增CO-XI基因的DNA片段，PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.7 μL，DNA模板1 μL，加入ddH2O至終體積20 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀觀察擴(kuò)增條帶。

1.4? ? 統(tǒng)計(jì)分析

將檢驗(yàn)合格的PCR產(chǎn)物做好標(biāo)記及編號(hào)，送至上海生工公司進(jìn)行序列雙向測定。將測序結(jié)果導(dǎo)入Chromas軟件中對(duì)測序結(jié)果峰值進(jìn)行人工校對(duì)，之后利用DNA MAN 9.0軟件對(duì)雙向測序結(jié)果進(jìn)行拼接，拼接出目的基因COXI基因序列，將序列拼接結(jié)果按“fasta”保存于記事本中。從NCBI數(shù)據(jù)庫中尋找其他豬種的COXI基因，按相同“fasta”格式將其保存于記事本中[6]，利用MEGA 7.0軟件，將豫西黑豬線粒體COXI基因與其他豬種相應(yīng)基因進(jìn)行剪切、比對(duì)，分析堿基組成及變異情況，觀察豫西黑豬與其他豬種間的遺傳距離。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? COXI基因序列擴(kuò)增及測序結(jié)果

2.1.1? ? COXI基因擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果分析。將電泳產(chǎn)物放在凝膠成像系統(tǒng)及紫外線燈照射下，可以見到1條清晰可見的明亮條帶[7]，條帶居于長度750～1 000 bp之間且基本處于中間位置，故可基本確定擴(kuò)增產(chǎn)物的目標(biāo)長度為864 bp，與預(yù)期基本相符。詳細(xì)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析見圖1。

2.1.2? ? COXI基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果分析。通過對(duì)豫西黑豬的線粒體COXI基因進(jìn)行測序，結(jié)果顯示，堿基之間無重疊，結(jié)果較為清晰，說明COXI基因擴(kuò)增、測序結(jié)果均符合預(yù)期，可以進(jìn)行后續(xù)的序列比對(duì)分析。

2.2? ? 豫西黑豬與其他不同豬種的COXI基因序列比對(duì)分析

將豫西黑豬線粒體COXI基因雙向測序的結(jié)果導(dǎo)入DN

AMAN 9.0軟件比對(duì)拼接，確定13個(gè)送檢樣品的COXI基因序列結(jié)果。同時(shí)，利用NCBI軟件Gene Bank數(shù)據(jù)庫下載的其他28種豬的線粒體COXI基因序列[8]。運(yùn)用MEGA 7.0軟件對(duì)比送測的13個(gè)豫西黑豬樣本的線粒體COXI序列，從中找出具有遺傳穩(wěn)定性的序列3個(gè)，并將送測的3個(gè)商品白豬中具有遺傳穩(wěn)定性的序列挑出。將選出的豫西黑豬、商品白豬及挑選出的21個(gè)其他不同豬種的線粒體COXI基因?qū)隡EGA 7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，將序列兩端不準(zhǔn)確及序列長度不同的序列進(jìn)行裁剪，剩下序列長度為832 bp。經(jīng)過比對(duì)，不同豬種間線粒體COXI基因的相似度均在96.5%以上。通過計(jì)算得出豫西黑豬線粒體COXI基因各堿基的平均含量比例分別為A 27.4%、T 31.9%、C 24.5%、G 16.2%，A+T的平均含量為59.3%，遠(yuǎn)高于C+G的平均含量40.7%，表現(xiàn)出A、T堿基偏好性。同時(shí)，相較于其他3種堿基，G堿基的含量最少，表現(xiàn)出明顯的非G堿基偏好性，這種非G偏愛（Ant

i-Ghias）的特性是后生動(dòng)物線粒體基因組L-鏈堿基組成所獨(dú)有的特點(diǎn)[9]。從序列角度看，12條豫西黑豬線粒體COXI序列中有10條基本相同，而剩余的2條堿基存在一定的差異，從10條不變基因中拿出1條與另外2條相比，存在8個(gè)變異位點(diǎn)。該現(xiàn)象說明，豫西黑豬種內(nèi)COXI基因存在差異性，證明豫西黑豬種間存在變異情況。

2.3? ? 不同豬種間線粒體COXI基因系統(tǒng)發(fā)育分析

在數(shù)據(jù)庫中找到民豬、大白豬、杜洛克豬等其他22個(gè)不同豬種的線粒體COXI基因序列。將豫西黑豬以及其他22個(gè)不同豬種的線粒體COXI基因?qū)隡EGA 7.0軟件中，采用鄰接法（NJ法）和最大似然法（ML法）基于COXI序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，其中NJ法是基于遺傳距離所建立的方法，不構(gòu)建聚類，直接為內(nèi)部節(jié)點(diǎn)計(jì)算距離，運(yùn)算速度最快;而最大似然法是基于特征的構(gòu)建方法，自動(dòng)檢索多次，可信度高[10]。構(gòu)樹成功后，據(jù)生成系統(tǒng)發(fā)育樹的圖像顯示，此25個(gè)不同樣本根據(jù)遺傳距離的遠(yuǎn)近及親緣性可以分為3個(gè)部分，其中豫西黑豬樣本中的1號(hào)、5號(hào)、16號(hào)遺傳距離較近，發(fā)生聚集;大白、長白、杜洛克等國外商品豬豬種遺傳距離較近，發(fā)生聚集;而榮昌豬、姜曲海豬等我國地方品種遺傳距離相對(duì)較近，發(fā)生聚集。同時(shí)，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的分支情況以及遺傳距離顯示，豫西黑豬與國內(nèi)其他豬種的遺傳距離大于豫西黑豬與杜洛克等國外商品豬種遺傳距離。因此，基本可以證明豫西黑豬樣本基因已經(jīng)發(fā)生混雜，故可推測豫西黑豬可能存在與杜洛克國外商品豬雜交等情況。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建情況詳見圖2、3。

3? ?結(jié)論

本文對(duì)豫西黑豬線粒體COXI基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增長度為864 bp，并對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，與其他22個(gè)不同豬種進(jìn)行序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，豫西黑豬與其他豬種的COXI基因具有高度一致性，同時(shí)存在大量變異位點(diǎn)，豫西黑豬種內(nèi)存在變異位點(diǎn)8個(gè)，說明豫西黑豬存在種內(nèi)變異;豫西黑豬與國外商品豬種存在變異位點(diǎn)24個(gè)，變異位點(diǎn)多;豫西黑豬與其他地方豬種存在變異位點(diǎn)17個(gè)，說明豫西黑豬與其他豬種間存在明顯差異，并存在與其他豬種基因混雜的可能。通過利用鄰接法和最大似然法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹可知，兩樹代表的分類意義基本一致，系統(tǒng)發(fā)生樹基本可分為3支，國外商品豬種遺傳距離較近分為一支，豫西黑豬樣本分為一支，但豫西黑豬種內(nèi)存在分支，其他地方豬種分為一支，從系統(tǒng)發(fā)生樹情況基本得知，豫西黑豬樣本與杜洛克等國外商品豬種基因混雜的可能性最大。該試驗(yàn)可為豫西黑豬保種復(fù)壯工作提供數(shù)據(jù)支撐，為豫西黑豬種質(zhì)基因提純工作提供了方向，并為其種質(zhì)資源保護(hù)提供科學(xué)參考。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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