反相高效液相色譜法測(cè)定不同煎煮時(shí)間夏枯草中丹參素、咖啡酸、迷迭香酸含量

張艷嬌 黃寬 向潤(rùn)清 方山丹 董帥 范源

摘要：目的? 建立反相高效液相色譜法測(cè)定不同煎煮時(shí)間夏枯草中丹參素、咖啡酸、迷迭香酸含量的方法，為夏枯草質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供參考。方法? 采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫20 ℃，流速1.0 mL/min，測(cè)定夏枯草煎煮25、30、35、40、45、50 min時(shí)丹參素、咖啡酸、迷迭香酸的含量。結(jié)果? 夏枯草中丹參素在0.62～4.34 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（r=0.999 8），咖啡酸在0.48～3.36 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（r=0.999 9），迷迭香酸在0.40～2.80 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（r=0.999 8）。夏枯草中的丹參素及咖啡酸在煎煮時(shí)間為25 min時(shí)含量最高，煎煮40 min時(shí)迷迭香酸含量最高。結(jié)論? 夏枯草中酚酸類(lèi)成分在不同煎煮時(shí)間含量不同，本研究可為確定夏枯草的最佳煎煮時(shí)間及其質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：夏枯草;丹參素;咖啡酸;迷迭香酸;煎煮時(shí)間;反相高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2020）02-0064-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201903382

Contents of Salvianic Acid A， Caffeic Acid and Rosmarinic Acid in Bupleuri Radix by RP-HPLC at Different Boiling Time

ZHANG Yanjiao1， HUANG Kuan1， XIANG Runqing1， FANG Shandan1， DONG Shuai1， FAN Yuan1，2

1. Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China;

2. The Second Affiliated Hospital of Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650216， China

Abstract： Objective To establish content determination method by RP-HPLC for salvianic acid A， caffeic acid and rosmarinic acid in Bupleuri Radix; To provide references for quality control and clinical medication of Bupleuri Radix. Methods The analysis was carried out on an Agilent C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m）， and the mobile phase was composed of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid aqueous with gradient elution. The detection wavelength was 280 nm， and the flow rate was 1.0 mL/min at column temperature of 20 ℃. The contents of salvianic acid A， caffeic acid and rosmarinic acid were measured when Bupleuri Radix was boiling for 25， 30， 35， 40， 45， and 50 min. Results The salvianic acid A in Bupleuri Radix was linear in the range of 0.62–4.34 μg （r=0.999 8）; the caffeic acid was linear in the range of 0.48–3.36 μg （r=0.999 9）; rosmarinic acid was linear in the range of 0.40– 2.80 μg （r=0.999 8）. The contents of salvianic acid A and caffeic acid in Bupleuri Radix was the highest when the boiling time was 25 min; the content of rosmarinic acid was the highest at 40 min. Conclusion The contents of phenolic acids in Bupleuri Radix change with boiling time， which can provide references for determining the optimal decoction time of Bupleuri Radix and its quality control.

Keywords： Bupleuri Radix; salvianic acid A; caffeic acid; rosmarinic acid; boiling time; RP-HPLC

夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有“主寒熱，瘰疬，鼠瘺，頭瘡，破徵，散癭結(jié)氣，腳腫濕痹”之效。研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草的主要化合物包括三萜類(lèi)、酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)等，具有降壓、免疫抑制、抗腫瘤、保肝、抑制胰脂肪酶活性等多種藥理作用[1]。夏枯草中的酚酸類(lèi)成分主要有丹參素、咖啡酸、迷迭香酸等。丹參素主要對(duì)心腦血管起到保護(hù)作用，且與腫瘤細(xì)胞分化、增殖、凋亡、腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的多種靶點(diǎn)相關(guān)[2];丹參素可顯著抑制胃癌、乳腺癌、黑色素瘤等多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[3]?？Х人崮芤种贫喾N腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[4];另具有收縮微血管、增強(qiáng)凝血因子水平、升高白細(xì)胞、血小板及止血作用，還可用于多種與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、病毒感染相關(guān)的疾病[5-6];此外，還具有抗氧化、降低抗癌藥物不良反應(yīng)、防止和逆轉(zhuǎn)化學(xué)物致癌、促進(jìn)凝血和傷口愈合作用[7-9]。迷迭香酸是夏枯草中典型的酚酸類(lèi)成分，可由一分子咖啡酸和一分子丹參素縮合而成，具有顯著的抗氧化、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗感染和抗微生物特性[10]，可治療內(nèi)分泌疾病及抗神經(jīng)退行性疾病等[11]，且具有顯著的抗腫瘤活性[12-14]。

原衛(wèi)生部、國(guó)家中醫(yī)藥管理局2009年下發(fā)的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》（國(guó)中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3號(hào)）規(guī)定：煎煮時(shí)間應(yīng)當(dāng)根據(jù)方劑的功能主治和藥物功效確定，浸泡時(shí)間一般不少于30 min，一般藥物煮沸后再煎煮20～30 min。本試驗(yàn)根據(jù)夏枯草中酚酸類(lèi)物質(zhì)的性質(zhì)及丹參素、咖啡酸、迷迭香酸的理化性質(zhì)，測(cè)定不同煎煮時(shí)間夏枯草水溶液中3種物質(zhì)含量變化，考察夏枯草的最佳煎煮時(shí)間，為臨床用藥提供參考。

1? 儀器與試藥

BY-500A高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，永康市速鋒工貿(mào)有限公司;Agilent 1200系列高效液相色譜儀（VWD紫外檢測(cè)器），美國(guó)安捷倫公司;FA1004N型萬(wàn)分之一電子分析天平，上海菁海儀器有限公司;KDM調(diào)溫電熱套，常州國(guó)華電器有限公司;EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司;YL-080ST型超聲清洗機(jī)，深圳市語(yǔ)路清洗設(shè)備有限公司。

丹參素對(duì)照品（批號(hào)wkq18061906，含量≥98%），四川維克奇生物科技有限公司;咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)160109，含量≥98%），四川維克奇生物科技有限公司;迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)S03N8H47130，含量≥98%），上海源葉生物科技有限公司。夏枯草樣品于2018年采自云南省文山州廣南縣（編號(hào)5334210306），經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥材優(yōu)良種苗繁育中心實(shí)驗(yàn)室李國(guó)棟鑒定為唇形科夏枯草屬夏枯草Prunella vulgaris L.。甲醇和乙腈均為色譜純，水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 混合對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取丹參素對(duì)照品3.10 mg、咖啡酸對(duì)照品2.40 mg、迷迭香酸對(duì)照品2.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇溶解并定容，即得丹參素、咖啡酸、迷迭香酸對(duì)照品溶液。再分別取丹參素、咖啡酸、迷迭香酸對(duì)照品溶液5.2、2、5 mL，定容至10 mL容量瓶中，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2? 供試品溶液制備

將夏枯草干燥果穗經(jīng)高速萬(wàn)能粉碎機(jī)打粉，過(guò)5號(hào)篩，備用。分別稱(chēng)取樣品粉末5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL純凈水，料液比為1∶20，置于同一圓底燒瓶、同一加熱套，沸騰回流加熱25、30、35、40、45、50 min，過(guò)濾，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，60 ℃濃縮，分別加入70%甲醇溶液15 mL使溶解，用0.45 ?m微孔濾膜過(guò)濾，即得不同煎煮時(shí)間夏枯草供試品溶液。

2.3? 色譜條件

采用ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫20 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相為乙腈和0.1%磷酸，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4? 線性關(guān)系考察

取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 ?m微孔濾膜過(guò)濾，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別取2、4、6、8、10、12、14 μL進(jìn)樣，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：丹參素Y=71.995X-1.657 1，r2=0.999 8;咖啡酸Y=128.09X-5.028 6，r2=0.999 9;迷迭香酸Y=137.56X-15.657，r2=0.999 8。結(jié)果表明，丹參素、咖啡酸、迷迭香酸分別在0.62～4.34 μg、0.48～3.36 μg、0.40～2.80 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5? 精密度試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算丹參素、咖啡酸、迷迭香酸的RSD分別為0.34%、0.27%、0.48%，表明儀器精密度良好。

2.6? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下煎煮25、40 min的夏枯草供試品溶液，稀釋3倍，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、14 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算丹參素、咖啡酸、迷迭香酸峰面積的RSD為0.73%、0.94%、1.45%，表明供試品溶液在14 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7? 重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下煎煮25、40 min的夏枯草供試品溶液各6份，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算丹參素、咖啡酸、迷迭香酸含量。結(jié)果在25 min時(shí)，丹參素、咖啡酸含量最高;在40 min時(shí)，迷迭香酸的含量最高。取煎煮25 min的夏枯草供試品溶液12份、煎煮40 min的夏枯草供試品溶液6份，分別稀釋3倍，使其峰面積在線性范圍內(nèi)，計(jì)算得丹參素、咖啡酸、迷迭香酸RSD分別為1.83%、1.67%、0.88%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8? 加樣回收率試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下煎煮25 min時(shí)已知丹參素含量為0.665 mg/g、咖啡酸含量為0.423 mg/g，煎煮40 min時(shí)已知迷迭香酸含量為0.599 mg/g的夏枯草濃縮浸膏（夏枯草煎液過(guò)濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60 ℃減壓濃縮）各6份，分別加入相當(dāng)于樣品中丹參素、咖啡酸、迷迭香酸含量100%的對(duì)照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果丹參素、咖啡酸、迷迭香酸的平均回收率分別為100.28%、98.53%、100.30%，RSD分別為2.08%、1.81%、1.09%，見(jiàn)表2。

2.9? 樣品含量測(cè)定

分別取25、30、35、40、45、50 min不同煎煮時(shí)間的夏枯草供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按回歸方程計(jì)算丹參素、咖啡酸、迷迭香酸含量，結(jié)果見(jiàn)表3，含量變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2。

3? 討論

本研究結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)，夏枯草中迷迭香酸的含量在煎煮時(shí)間為40 min時(shí)最高，且變化較為明顯;在線性范圍內(nèi)，丹參素、咖啡酸的含量在煎煮25 min時(shí)含量最高，咖啡酸在煎煮25 min后的變化較小，這2種成分在煎煮25 min以內(nèi)的含量變化還需進(jìn)一步研究。

結(jié)合本課題前期研究考察不同煎煮時(shí)間發(fā)現(xiàn)，采用電磁爐加熱，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，水分蒸發(fā)較多，導(dǎo)致煎煮液較少，甚至完全蒸發(fā)，故試驗(yàn)結(jié)果誤差較大;在進(jìn)行對(duì)比后，采用電熱套加熱回流，使方法進(jìn)一步完善，增加了結(jié)果的可靠性。

本試驗(yàn)先后考察了以乙腈-0.05%、0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相，洗脫梯度，以及25、30 ℃柱溫設(shè)置，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用0.1%磷酸水溶液、柱溫為20 ℃時(shí)，更有利于丹參素、咖啡酸、迷迭香酸3種成分的分離。

本研究考察了不同煎煮時(shí)間夏枯草中丹參素、咖啡酸、迷迭香酸的含量變化，結(jié)果表明，在煎煮25 min后丹參素的含量變化明顯，可能與其不穩(wěn)定有關(guān);咖啡酸的含量變化趨于穩(wěn)定。提示隨著煎煮時(shí)間變化，藥物各組分之間可能發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，影響中藥某些成分的含量[15]。本試驗(yàn)可為確定夏枯草的最佳煎煮時(shí)間及其質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供一定參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李詠梅，肖冰梅.夏枯草的藥用研究概述[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2013， 11（19）：479-480.

[2] 徐麗靜，王穎.丹參素抗腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].浙江中醫(yī)雜志， 2016，51（9）：700-701.

[3] 李驊，王四旺，張邦樂(lè)，等.丹參素的藥理活性和藥物動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6（2）：110-112.

[4] 牟艷鈴，于人江，解硯英，等.咖啡酸對(duì)阿糖胞苷致小鼠白細(xì)胞、血小板減少及血小板體積變化的預(yù)防和治療作用[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2008，13（5）：508-511.

[5] PRASAD N R， JEYANTHIMALA K， RAMACHANDRAN S. Caffeic acid modulates ultraviolet radiation-B induced oxidative damage in human blood lymphocytes[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology，2009，95（3）：196-203.

[6] 楊九凌，祝曉玲，李成文，等.咖啡酸及其衍生物咖啡酸苯乙酯藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，48（8）：577-582.

[7] 楊葉，李磊.咖啡酸及其衍生物抗腫瘤作用分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2013，34（19）：341-345.

[8] SONG H S， PARK T W， SOHN U D， et al. The effect of caffeic acid on wound healing in skin-incised mice[J]. The Korean Journal of Physiology and Pharmacology，2008，12（6）：343-347.

[9] 孫皓熠，郝寶燕，張浩超，等.咖啡酸研究概況[J].食品與藥品，2017， 19（2）：151-154.

[10] ANDRADE J M， FAUSTINO C， GARCIA C. Rosmarinus officinalis L.：an update review of its phytochemistry and biological activity[J]. Future Science OA，2018，4（4）：283.

[11] TAI J， CHEUNG S， WU M， et al. Antiproliferation effect of rosemary （Rosmarinus officinalis） on human ovarian cancer cells in vitro[J]. Phytomedicine，2012，19（5）：436-443.

[12] DORRIE J， SAPALA K， ZUNINO S J. Carnosol-induced apoptosis and downregulation of Bcl-2 in B-lineage leukemia cells[J]. Cancer Lett，2001，170（1）：33-39.

[13] TSAI C W， LIN C， WANG Y， et al. Carnosic acid induces the NAD（P）H：Quinone oxidoreductase 1 expression in rat clone 9 cells through the p38/nuclear factor erythroid-2 related factor 2 pathway[J]. Journal of Nutrition，2011，141（12）：2119-2125.

[14] BARNI M V， CARLINI M J， CAFFERATA E G， et al. Carnosic acid inhibits the proliferation and migration capacity of human colorectal cancer cells[J]. Oncol，2012，27（4）：1041-1048.

[15] 郭允，張家成，彭智平.煎煮時(shí)間對(duì)中藥湯劑質(zhì)量影響[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（2）：24-25.

（收稿日期：2019-03-28）

（修回日期：2019-04-20;編輯：陳靜）

基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃[2017FF117（-008）]

通訊作者：范源，E-mail：1647909799@qq.com