大黃對脂多糖致RAW264.7細胞炎癥模型mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路的影響

董偉 楊愛東 李小茜 吳中華 符勝光

摘要：目的? 觀察大黃對脂多糖致RAW264.7細胞炎癥模型mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路的影響，探討其作用機制。方法? 實驗細胞分為正常組、模型組、雷帕霉素組和大黃低、中、高劑量組，MTT法檢測細胞毒性后，ELISA檢測白細胞介素（IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，實時熒光定量PCR檢測缺氧誘導因子-lα （HIF-1α）、p70S6K1和eIF4E mRNA表達，Western blot檢測雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、HIF-1α、血管內皮生長因子（VEGF）蛋白表達。結果? 與正常組比較，模型組細胞TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯升高（P<0.05，P<0.01），HIF-1α、eIF4E和p70S6K1 mRNA表達明顯升高（P<0.05，P<0.01），HIF-1α和VEGF蛋白表達明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，大黃各劑量組細胞TNF-α、IL-6和IL-1β含量降低，HIF-1α、p70S6K1和eIF4E mRNA表達降低，HIF-1α、VEGF蛋白表達降低。結論? 大黃可下調炎癥因子水平，其機制可能與其下調HIF-1α、VEGF蛋白表達及HIF-1α、eIF4E、p70S6K1 mRNA表達水平有關。

關鍵詞：炎癥;大黃;mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路;細胞

中圖分類號：R285.5? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）02-0038-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201906319

Effects of Rhei Radix et Rhizoma on mTOR/HIF-1α/VEGF Signal Pathway in Cell RAW264.7 Inflammation Model Induced by LPS

DONG Wei， YANG Aidong， LI Xiaoqian， WU Zhonghua， FU Shengguang

School of Basic Medical Sciences， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，

Shanghai 201203， China

Abstract： Objective To observe the effects of Rhei Radix et Rhizoma on mTOR/HIF-1α/VEGF signal pathway in cell RAW264.7 inflammation model induced by LPS. Methods Experimental cells were divided into normal group， model group， rapamycin group and Rhei Radix et Rhizoma low-， medium-， and high-dosage groups. After MTT inspection for cytotoxicity， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 were measured by ELISA; Expression of HIF-1α， p70S6K1， eIF4E mRNA were detected by PCR; Expression of mTOR， HIF-1α and VEGF protein detected by Western blot. Results Compared with the normal group， the levels of TNF-α， IL-6 and IL-1β in the model group significantly increased （P<0.05， P<0.01）; the mRNA expressions of HIF-1α， EIF4E and p70S6K1 in the model group significantly increased （P<0.05， P<0.01）; the protein expressions of HIF-1α and VEGF in the model group significantly increased （P<0.05）. Compared with the model group， the levels of TNF-α， IL-6， and IL-1β in Rhei Radix et Rhizoma groups decreased; the mRNA expressions of HIF-1α， p70S6K1 and eIF4E decreased; the protein expression of HIF-1α and VEGF decreased. Conclusion Rhei Radix et Rhizomacan decrease the levels of inflammatory factors， and the mechanism may be related to down-regulating the protein expressions of HIF-1α and VEGF and mRNA expressions of HIF-1α， eIF4E， and p70S6K1.

Keywords： inflammation; Rhei Radix et Rhizoma; mTOR/HIF-1α/VEGF signal pathway; cells

炎癥是由各種炎性細胞分泌的炎癥介質和細胞因子共同介導的綜合防御體系。然而，當炎癥過度或調控不當時，會引起各種病理表現(xiàn)，如間質性肺炎、纖維素性心包炎等。研究表明，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）與炎癥、損傷、增生、組織修復、纖維化及腫瘤發(fā)生發(fā)展等一系列重要的病理生理過程密切相關。缺氧誘導因子-lα（HIF-1α）在脂多糖（LPS）誘導的炎癥反應中起重要作用。血管內皮生長因子（VEGF）可被炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6等誘導和調控[1]。大黃味苦，性寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)和利濕退黃功效。目前對大黃調控炎癥的機制還未明確，本研究通過建立LPS誘導RAW264.7細胞炎癥模型，探討大黃對LPS誘導細胞炎癥模型mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路的影響，為臨床上大黃治療炎癥提供實驗依據(jù)。

1? 實驗材料

1.1? 細胞及培養(yǎng)

小鼠巨噬細胞RAW264.7，中國科學院上海細胞庫提供。細胞加入DMEM高糖培養(yǎng)基，置于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。當細胞融合80%～90%進行傳代。傳代后吸棄DMEM高糖培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，再加入新鮮常溫胎牛血清，輕輕沿一個方向吹打細胞，傳代比例為1∶4，實驗用對數(shù)生長期的RAW264.7細胞進行。

1.2? 藥物及制備

大黃，購于上海同濟堂藥業(yè)有限公司，批號170401。取大黃126 g置于煎藥壺內，加藥物體積8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮30 min，過濾，再加6倍量水繼續(xù)煎煮30 min，過濾，合并濾液，濃縮至300 mL，將濃縮液分裝在不同的塑料瓶內，高度不超過1 cm，用保鮮膜包裹塑料瓶兩層，置于-80 ℃冰箱凍存。使用時將藥液從冰箱取出，放入凍干機53 h，得凍干粉7.5 g，得粉率6%。雷帕霉素片，APExBIO，批號A8167。

1.3? 主要試劑與儀器

LPS O55：B5（Sigma，057M4013V），BSA試劑盒（上海碧云天），RPMI1640培養(yǎng)液（日本Gibco），TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA檢測試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司），mTOR抗體、HIF-1α抗體、VEGF抗體（美國Abcam），Trizol（Invitrogen），RT試劑盒（TAKARA），無水酒精、甲醇、異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司）。低溫冷凍離心機3K15（美國Sigma），酶標儀680型（美國Bio-Rad），SDS-PAGE電泳儀（MINI Protean2，美國Bio-Rad），BH2顯微鏡（日本Olympus），實時熒光定量PCR儀（7500fast，美國ABI）。

1.4? 內毒素溶液配制

稱適量LPS粉末于1.5 mL EP管中，加入無菌PBS溶解配制為10 mg/mL溶液，震蕩，使其充分溶解，分裝，置于-20 ℃冰箱保存。使用時用無菌PBS稀釋至1 mg/mL，加入細胞培養(yǎng)液稀釋至終濃度為1 μg/mL。

2? 實驗方法

2.1? 分組、造模和給藥

實驗分為空白組、模型組、雷帕霉素組和大黃低、中、高劑量組。細胞常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，消化調整細胞濃度至2×105個/mL，接種至6孔板，每孔2 mL;第2日待細胞融合80%～90%，分別加入不同劑量大黃凍干粉（200、400、800 μg/mL）、空白培養(yǎng)液及雷帕霉素藥液（30 nmol/L），每組設3個復孔;培養(yǎng)24 h后加入LPS（500 ng/mL），繼續(xù)培養(yǎng)2 h;每孔完全吸棄培養(yǎng)液后，常溫無菌PBS洗滌細胞;每孔完全吸棄PBS后加入200～300 μL RIPA裂解液，使雷帕霉素藥液均勻平鋪于孔底，然后置于水平搖床，震蕩10 min，使細胞與裂解液完全充分接觸;吸取6孔板中每孔細胞懸液放入EP管，4 ℃、1500 r/min離心10 min，分離細胞上清液，取新的1.5 mL EP管，吸取細胞上清液，置于-80 ℃冰箱保存。

2.2? Western blot檢測雷帕霉素靶蛋白、缺氧誘導因子-lα、血管內皮生長因子蛋白表達

用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入相應上樣緩沖液及RIPA裂解液，水浴鍋100 ℃，10 min完成蛋白變性。配制6%分離膠，5%濃縮膠，細胞每孔上樣量10 μL，經(jīng)SDS-PAGE垂直凝膠設置80 V、120 min進行電泳，通過恒流350 mA、200 min轉膜將蛋白轉移至PVDF膜。采用QuickBlock? Western封閉液，將膜放置于水平搖床上室溫封閉約10 min后，將膜按分子量位置剪成4段后，分別加用一抗稀釋液稀釋后的mTOR（289 kD）、VEGF（210 kD）、HIF-1α（120 kD）及β-actin（42 kD）內參抗體，4 ℃搖床孵育過夜。次日洗膜，TBST沖洗3次×10 min，再加相應二抗室溫孵育1 h，TBST沖洗3次×10 min，ECL試劑曝光顯影。結果用靶蛋白/內參蛋白灰度比值表示。

2.3? ELISA檢測腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β和白細胞介素-6含量

收集細胞培養(yǎng)上清液，1500 r/min離心10 min，取上清液，ELISA測定TNF-α、IL-1β和IL-6含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.4? PCR檢測缺氧誘導因子-lα、p70S6K1和eIF4E mRNA表達

吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗1次，采用Trizol法提取RNA，分光光度計檢測RNA濃度，10 μL Sybr green+2 μL反轉錄產(chǎn)物+1 μL上游引物+1 μL下游引物+水ddH2O，共20 μL，進行反轉錄反應。PCR擴增條件：95 ℃、30 s，40個循環(huán)（95 ℃、5 s，60 ℃、34 s），引物序列見表1。

3? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗結果以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用ANOVA法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4? 結果

4.1? MTT細胞毒性結果

大黃濃度1600 μg/mL細胞抑制率為22.27%，大黃濃度800 μg/mL細胞抑制率幾乎為0%，大黃濃度與細胞抑制率呈正相關，至大黃濃度200 μg/mL，細胞抑制率基本保持穩(wěn)定，故選取大黃濃度200、400、800 μg/mL為細胞實驗濃度。

4.2? 大黃對細胞模型腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β和白細胞介素-6含量的影響

與正常組比較，模型組細胞TNF-α、IL-6 和IL-1β含量明顯升高（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，雷帕霉素組細胞TNF-α、IL-1β含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），大黃低劑量組細胞TNF-α含量明顯降低（P<0.05），大黃高劑量組細胞IL-6、IL-1β含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結果見表2。

4.3? 大黃對細胞模型缺氧誘導因子-lα、p70S6K1和eIF4E mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組細胞HIF-1α、eIF4E、P70S6K1 mRNA表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，雷帕霉素組細胞p70S6K1 mRNA表達明顯升高（P<0.01）;大黃各劑量組細胞HIF-1α、p70S6K1、eIF4E mRNA表達降低，除大黃中劑量組eIF4E mRNA表達外，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結果見表3。

4.4? 大黃對細胞模型雷帕霉素靶蛋白、缺氧誘導因子-lα、血管內皮生長因子蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組細胞HIF-1α、VEGF蛋白表達明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，大黃各劑量組細胞VEGF蛋白表達明顯降低（P<0.05，P<0.01），大黃中劑量組細胞mTOR蛋白表達均明顯降低（P<0.05），大黃高劑量組細胞HIF-1α蛋白表達明顯降低（P<0.05）。結果見圖1、圖2。

5? 討論

炎癥及炎癥反應廣泛存在于心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)疾病中。正常炎癥反應有助于機體清除致病因素、壞死組織及受損細胞，增強機體再生修復能力，減輕各種炎癥因子和介質的合成與釋放、控制炎癥范圍、阻礙炎癥損傷的進一步發(fā)展，但過度的炎癥反應對機體有害，可能導致機體的二次或更嚴重的病理反應，嚴重者可產(chǎn)生“瀑布樣反應”，最終形成多器官功能障礙綜合征[2-4]，從而導致死亡。

根據(jù)炎癥具體臨床表現(xiàn)如紅、腫、熱、痛和其他反應等，可將其歸屬于中醫(yī)學“熱證”“陽證”“火證”等范疇?！端貑枴ぶ琳嬉笳撈贰笆⒄邽a之”“留者攻之”。《素問·陰陽應象大論篇》“中滿者，瀉之于內”“其實者，散而瀉之”。疾病的發(fā)生主要取決于人體生理功能完整及全身氣血正常運行，無論外感還是內傷，病邪侵襲人體各臟腑組織經(jīng)絡時會導致人體氣機紊亂，產(chǎn)生有形實邪或無形邪氣積聚不去，如火、熱毒、痰、瘀等諸邪，“六腑以通為順”，通過下法可清除這些積滯在人體中的病邪，以使全身氣血運行通暢，進而促進人體各生理活動正常進行。

大黃具有瀉熱毒、破積滯、行瘀血功效?！渡褶r本草經(jīng)》云其具有“下瘀血，血閉寒熱，破癥瘕積聚，留飲宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調中化食，安和五臟”之功效?！睹t(yī)別錄》認為其能“平胃、下氣，除痰實，腸間結熱，心腹脹滿”。

mTOR可整合營養(yǎng)、能量及生長因子等多種細胞外信號，與人體炎癥、損傷、增生、組織修復、纖維化及腫瘤發(fā)生發(fā)展等一系列重要的病理生理過程密切相關。mTOR主要通過p70S6K及4E-BP1來調節(jié)下游蛋白質翻譯[5]。當mTOR磷酸化4E-BP1后，可使其激活。4E-BP1磷酸化可破壞這種結合，從而釋放出eIF4E，并使其磷酸化后激活相關蛋白的翻譯[6-7]，其中包括HIF-1α的蛋白翻譯[8]。

HIF-1α是哺乳動物機體在缺氧條件下非常重要的轉錄調節(jié)因子。HIF-1α被認為在LPS誘導的炎癥反應中起重要作用。研究表明，核因子-κB可通過HIF-1α依賴性與非依賴性的方式促進巨噬細胞分泌炎癥因子[9-10]。限制巨噬細胞HIF-1α介導的炎癥反應可能有益于減輕炎癥相關的組織損傷。大量研究表明，炎癥時HIF-1α被激活，其下游許多經(jīng)典靶基因如VEGF的表達被上調[11]，尤其是HIF-1α可促進炎癥因子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-6等。敲除巨噬細胞中HIF-1α能明顯減輕LPS導致的敗血癥與動物的死亡率，降低炎癥因子的產(chǎn)生，進一步證明LPS對HIF-1α的誘導作用，提示HIF-1α在炎癥反應中的潛在作用[12]。VEGF是強大的血管通透因子，也是組織生長和修復所必需的。研究表明，細胞因子網(wǎng)絡對VEGF也有調控作用，IL-6、TNF-α等細胞因子能誘導VEGF合成。

本研究針對不同大黃濃度MTT細胞毒性測試結果表明，大黃濃度越低，細胞抑制率越低，直到大黃濃度為200 μg/mL時細胞抑制率保持穩(wěn)定。

本實驗結果表明，與正常組比較，模型組細胞TNF-α、IL-6和IL-1β含量明顯升高，說明成功建立LPS致RAW264.7細胞炎癥模型。與模型組比較，大黃各劑量組細胞TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯降低，且HIF-1α、p70S6K1和eIF4E mRNA表達顯著降低，HIF-1α、VEGF蛋白表達明顯降低。綜上，大黃下調內毒素誘導RAW264.7細胞模型炎癥因子的機制可能與其下調HIF-1α、VEGF蛋白及HIF-1α、eIF4E、p70S6K1 mRNA表達有關。

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（收稿日期：2019-06-21）

（修回日期：2019-08-09;編輯：華強）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2018YFC1704102）;國家自然科學基金面上項目（81673855）;上海市進一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃[ZY（2018-2020）-CCCX-2001-01];上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床基礎學科（A1-Z193020109）

通訊作者：楊愛東，E-mail：aidongy@126.com