終板下椎體缺血誘導(dǎo)兔椎間盤退行性變模型的建立及終板中內(nèi)皮素1的表達(dá)

袁 維，周小小，蔡 攀，陳 誠，郭勝洋，吳佳俊，錢 明

1.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院骨科，上海 200081

2.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院骨科，上海 201318

3.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院骨科，上海 200003

椎間盤是人體最大的無血管組織，其營養(yǎng)供應(yīng)通過終板和纖維環(huán)擴(kuò)散入椎間盤內(nèi)。椎體終板通路是椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)的主要途徑，正常椎間盤營養(yǎng)的75%來自椎體終板的滲透，終板發(fā)生退行性變引起椎間盤營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)減少是導(dǎo)致椎間盤發(fā)生退行性變的始動(dòng)因素[1］?？菇K板退行性變?yōu)榉乐巫甸g盤退行性變提供了新的思路。修復(fù)椎間盤退行性變的研究前提是建立合適的動(dòng)物模型。目前，較常用的模型建立方法是纖維環(huán)穿刺或穿刺結(jié)合髓核抽吸[2-4］，穿刺損傷模型操作較簡單、重復(fù)性好，且退行性變發(fā)展緩慢、便于觀察及干預(yù)，但穿刺針的型號(hào)、進(jìn)針的深度需要進(jìn)行精確計(jì)算，其最大的缺點(diǎn)是髓核組織丟失，導(dǎo)致發(fā)生退行性變的過程與自然退行性變有較大的差別，不能全面反映椎間盤退行性變機(jī)制。

終板退行性變包含一系列復(fù)雜的病理變化，如炎性遞質(zhì)釋放、營養(yǎng)供應(yīng)下降等[5］。發(fā)生退行性變的軟骨終板組織內(nèi)ET-1 呈高表達(dá)，并且退行性變的軟骨終板細(xì)胞自身能表達(dá)ET-1，ET-1 作用于軟骨終板細(xì)胞促使其分泌基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）、MMP-13 和一氧化氮（NO），導(dǎo)致終板細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原降解，進(jìn)而引起終板退行性變[6］。因此，ET-1 在椎間盤終板退行性變中起著重要作用，可能成為該病治療的新靶點(diǎn)。

本研究旨在探索一種建立椎間盤退行性變模型的新方法，從營養(yǎng)供應(yīng)障礙方面著手，通過終板下注入醫(yī)用無水乙醇阻斷椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)，模擬椎間盤退行性變的自然過程。無水乙醇作為微循環(huán)破壞試劑，具有去血管化作用，可使椎體內(nèi)骨髓血管內(nèi)皮細(xì)胞迅速脫水、蛋白質(zhì)變性凝固、小血管閉塞，從而造成微循環(huán)破壞[7-8］。本研究組前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)無水乙醇注射到鼠尾終板下椎體內(nèi)可阻斷椎間盤的主要營養(yǎng)途徑，導(dǎo)致椎間盤退行性變的發(fā)生[9］。本研究選用新西蘭大白兔，將無水乙醇注射到椎體內(nèi)終板下，使滋養(yǎng)血管栓塞缺血、導(dǎo)致椎間盤營養(yǎng)物質(zhì)供給障礙，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤退行性變，并觀察在終板退行性變過程中ET-1 的表達(dá)情況，為后期終板退行性變的修復(fù)提供切入點(diǎn)及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要材料、儀器

健康4 月齡新西蘭兔由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物許可證號(hào):SYXK（滬）2018-0040］，雌雄不限，體質(zhì)量（3 000±20）g，經(jīng)腰椎X 線和MRI 檢查排除脊柱的先天性疾病和椎間盤退行性變后納入實(shí)驗(yàn)。腰椎骨穿刺針（天津金興達(dá)實(shí)業(yè)有限公司，中國），醫(yī)用無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國），氯胺酮、地西泮（福建古田藥業(yè)有限公司，中國），ET-1 抗體（Thermo Scientific，美國）。光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本），數(shù)字化計(jì)算機(jī)成像X 線機(jī)和3.0 T醫(yī)用超導(dǎo)型磁共振掃描儀（Philips，荷蘭）。

1.2 建模方法

將32 只兔隨機(jī)分為4 組，每組8 只，選取L5，6椎體（對(duì)應(yīng)L4/L5及L5/L6椎間盤）注射300 μL無水乙醇造模，選取L4椎體（對(duì)應(yīng)L3/L4椎間盤）注射磷酸鹽緩沖液（PBS）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，L7椎體（對(duì)應(yīng)L6/L7椎間盤）未注入任何物質(zhì)作為正常對(duì)照。按3%氯胺酮（30 mg/kg）加0.5%地西泮（2 mg/kg）進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉。將兔右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，在左側(cè)腰背部剃毛備皮，通過左側(cè)腹膜后入路，利用手提式X 線透視儀，側(cè)位透視顯示14G 腰椎骨穿刺針尖位于椎體前2/5 與后3/5 交界處；正位透視下，骨穿刺針在椎體左側(cè)中央處與椎體成45°角斜向下方刺入椎體，緩慢進(jìn)針，至針尖達(dá)終板側(cè)椎體中心，距離終板軟骨約3 mm，將注射液注入椎體骨髓腔內(nèi)，速率為50 μL/min，留針6 min，然后緩慢拔針。用4-0 Vicryl 可吸收線縫合切口。于術(shù)前和術(shù)畢肌內(nèi)注射慶大霉素80 000 U，連續(xù)應(yīng)用3 d。術(shù)后連續(xù)3 d 頸部皮下注射卡洛芬（0.2 mg，每日2 次）鎮(zhèn)痛，口服復(fù)方新諾明抗生素藥水（48 mg/mL）1 周后改用正常純凈水。術(shù)后動(dòng)物自由活動(dòng)。

1.3 X 線檢查測量椎間隙高度

術(shù)前和術(shù)后1、3、5個(gè)月，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后行X 線檢查。攝影條件:50 mA，50 kV。參照Kim 等[10］的“三中線法”測量椎間隙高度，即在兔腰椎側(cè)位X線片上，選擇最上2 個(gè)和最下2 個(gè)椎體角為標(biāo)記點(diǎn)，經(jīng)過這4 點(diǎn)做2 條沿脊柱縱軸方向的直線，再沿相同方向做3 條直線（A、B 及C）均分先前2 條直線間的距離。再將這3 條直線經(jīng)過椎間隙長度分別標(biāo)記為D、E 及F，則該節(jié)段椎間盤高度為（D+E+F）/3。采用Han 等[11］的方法進(jìn)行椎間盤高度指數(shù)（DHI）計(jì)算，即將椎間盤寬度四等分，測量中點(diǎn)及其兩側(cè)各25%位點(diǎn)相鄰椎體及椎間盤的高度。

1.4 椎間盤退行性變評(píng)估

術(shù)前和術(shù)后1、3、5 個(gè)月，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后行MRI 掃描。頸椎線圈通過椎間盤矢狀正中切面，采用自旋回波序列（TR:3 000 ms，TE:120 ms）無間距掃描。采用改良Pfirrmann 分級(jí)系統(tǒng)[12］進(jìn)行退行性變程度分級(jí)。所有MRI 影像資料均由3 位資深MRI 醫(yī)師盲法閱片。

1.5 椎間盤組織病理學(xué)觀察

術(shù)后1、3、5 個(gè)月，在X 線和MRI 檢查后，各取1 組動(dòng)物給予二氧化碳（CO2）吸入處死。將整個(gè)腰椎完整取出，放入10%中性甲醛溶液中浸泡48 h 后水洗20 min，然后放入脫鈣液（按氯化鋁7 g、濃鹽酸8.5 mL 及甲酸50 mL，加蒸餾水至100 mL 配制）脫鈣4 ～ 5 d，以細(xì)針刺入椎體內(nèi)無阻力為宜。沖洗15 min，于正中矢狀位剖開標(biāo)本，放入50%無水乙醇浸泡后，常規(guī)包埋、制成蠟塊。4 μm 切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色。光學(xué)顯微鏡下觀察終板及椎間盤的組織病理學(xué)變化。

1.6 終板組織ET-1表達(dá)的檢測

術(shù)后1、3、5 個(gè)月，收集終板組織進(jìn)行石蠟包埋，制成組織切片，進(jìn)行ET-1 抗體（1∶100）免疫組織化學(xué)染色，檢測PBS 對(duì)照和退行性變終板ET-1 表達(dá)情況。用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行平均光密度定量測定。

1.7 退行性變軟骨終板細(xì)胞中ET-1表達(dá)的檢測

術(shù)后1 個(gè)月時(shí)，取1 組新西蘭大白兔，無菌情況下獲取退行性變軟骨終板組織，在超凈臺(tái)內(nèi)借助4倍放大鏡仔細(xì)剔除骨屑、髓核和纖維環(huán)殘留組織，PBS 液沖洗獲得較潔白的終板組織。在含有3%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中加入0.15%Ⅱ型膠原酶，過濾除菌后加入終板組織。在10 cm2培養(yǎng)皿中用眼科剪將軟骨終板組織剪碎至約1 mm3大小，移入50 mL 離心管內(nèi)，在37℃下200 r/min 振蕩，持續(xù)消化12 h。消化后的混合物用70 μm 濾網(wǎng)過濾，然后以1 200 r/min（離心半徑為160 mm）離心5 min；去除上清液，取沉淀細(xì)胞懸液；加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，1 000 r/min（離心半徑為160 mm）離心5 min，去除上清液，重復(fù)3 次；按細(xì)胞密度約5×105/mL 接種于底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM，每3 d 換液1 次，隔天用倒置顯微鏡觀察、拍照。

將細(xì)胞接種在12 孔板內(nèi)，達(dá)到80%融合時(shí)，用PBS 清洗3 次，每次2 min；然后用4%多聚甲醛固定30 min，水洗15 min，雙蒸水洗5 min；室溫下加入甲苯胺藍(lán)染色4 h，再水洗；自然晾干細(xì)胞爬片后，用中性樹膠封片，進(jìn)行軟骨終板細(xì)胞鑒定。

將已消毒的10 mm蓋玻片置于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，按5×104/mL的密度接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)進(jìn)行ET-1 抗體（1∶100）免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色，觀察ET-1 的表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以s 表示，不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用方差分析；以P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 影像學(xué)評(píng)估椎間盤退行性變情況

X線片示注射無水乙醇后椎間隙變窄，椎間隙邊緣骨贅增生（圖1）。注射PBS后1、3、5個(gè)月，L3/L4DHI分別為注射前的（99.3±1.1）%、（98.8±1.6）%和（98.2±1.3）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）；注射無水乙醇后1 個(gè)月，L4/L5和L5/L6DHI 為注射前的（92.1±2.8）%，3 個(gè)月時(shí)降至（72.2±6.5）%，5 個(gè)月時(shí)降至（54.3±6.0）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

MRI 示隨觀察時(shí)間延長，注射無水乙醇后L4/L5和L5/L6椎間盤信號(hào)改變明顯（圖2），MRI T2WI 低信號(hào)，椎間盤退行性變加劇。按改良Pfirrmann 分級(jí)，1 個(gè)月時(shí)為3 ～ 4 級(jí)，3 個(gè)月時(shí)為5 ～ 6 級(jí)，5 個(gè)月時(shí)為7 ～ 8 級(jí)。

圖 1 注射無水乙醇后腰椎椎間盤X線影像Fig. 1 Roentgenographs of lumbar disc after injection of absolute ethanol

圖2 注射無水乙醇后腰椎椎間盤MRI 影像Fig. 2 MRI of lumbar disc after injection of absolute ethanol

2.2 終板組織學(xué)觀察

HE 染色結(jié)果顯示:在無水乙醇注射后，終板逐漸出現(xiàn)退行性變，生長板厚度逐漸變薄，進(jìn)而終板結(jié)構(gòu)破損，同時(shí)軟骨終板細(xì)胞退化、直至消失；髓核內(nèi)以脊索細(xì)胞為主，在第1 個(gè)月時(shí)空泡狀細(xì)胞增多，第3 個(gè)月后逐漸轉(zhuǎn)化為以軟骨樣細(xì)胞為主，隨著髓核纖維化進(jìn)展，在第5 個(gè)月時(shí)殘留在纖維組織的髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為纖維軟骨樣細(xì)胞；隨著退行性變加重，纖維環(huán)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)排列紊亂，失去同心圓狀規(guī)則排列，板層松散、斷裂，纖維化程度加重。見圖3。

2.3 終板組織免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，PBS 對(duì)照近乎陰性表達(dá)（圖4a，光密度為0.012 1±0.000 7）。無水乙醇注射后1 個(gè)月終板軟骨細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯示較強(qiáng)陽性ET-1 表達(dá)（圖4b，光密度為0.257 3±0.024 1），3 個(gè)月時(shí)為陽性表達(dá)（圖4c，光密度為0.192 2±0.015 5），隨著終板退行性變加劇，軟骨細(xì)胞活性降低，第5個(gè)月時(shí)ET-1 表達(dá)下降（圖4d，光密度為0.086 9±0.006 1）。

2.4 軟骨終板細(xì)胞ET-1 表達(dá)

提取的軟骨終板細(xì)胞成功進(jìn)行了原代和傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下可見原代細(xì)胞12 ～ 24 h貼壁，48 h后細(xì)胞開始增殖，約7 d 出現(xiàn)細(xì)胞集落，約14 d 鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿，細(xì)胞形態(tài)多樣，從梭形到多邊型不等（圖4e）；甲苯胺藍(lán)染色可見細(xì)胞質(zhì)有藍(lán)色異染出現(xiàn)（圖4f）；免疫組織化學(xué)染色顯示終板軟骨細(xì)胞內(nèi)ET-1 呈強(qiáng)表達(dá)，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖4g、h）。

圖 3 注射無水乙醇后腰椎終板、髓核和纖維環(huán)退行性變的病理學(xué)變化（HE 染色）Fig. 3 Pathological changes of lumbar endplate，nucleus pulposus and annulus fibrosus degeneration after injection of absolute ethanol（HE staining）

圖 4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig. 4 Immunohistochemical staining results

3 討 論

椎間盤是脊柱運(yùn)動(dòng)功能單位中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，在解剖上分為終板、髓核和纖維環(huán)3 個(gè)部分，由于其解剖結(jié)構(gòu)特殊，易發(fā)生退行性病變。有研究[13-15］顯示，其發(fā)生機(jī)制包括椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)障礙，炎癥介質(zhì)的釋放，細(xì)胞凋亡、老化和死亡，降解酶活性增高而抑制因子降低，遺傳因素等。上、下終板位于髓核的兩端，具有防止髓核突入椎體、控制椎間盤營養(yǎng)滲透和承接緩沖負(fù)荷的作用，對(duì)維持椎間盤內(nèi)的正常形態(tài)和生理功能具有重要意義。營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)障礙是導(dǎo)致椎間盤退行性變的關(guān)鍵因素。營養(yǎng)供應(yīng)減少后髓核內(nèi)代謝產(chǎn)物排出出現(xiàn)障礙，伴隨降解基質(zhì)酶活性增高，損傷髓核細(xì)胞，髓核處于酸性較高的環(huán)境，這種連鎖反應(yīng)導(dǎo)致退行性變進(jìn)一步加劇。同時(shí)，椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)減少會(huì)導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞數(shù)量下降，進(jìn)而細(xì)胞外基質(zhì)（蛋白多糖和Ⅱ型膠原）進(jìn)行性減少，引起椎間盤退行性變[16-18］。此外，有研究顯示，異常應(yīng)力作用可使終板發(fā)生硬化、鈣化及骨化，椎間盤營養(yǎng)供給被阻斷，必然也造成其退行性變[19］。因此，要修復(fù)發(fā)生退行性變的椎間盤，首先要從病因?qū)W上了解退行性變過程及機(jī)制，其中最好的辦法是模擬椎間盤退行性變的自然病程，從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)及生物化學(xué)等多角度進(jìn)行相關(guān)研究，進(jìn)而有的放矢地進(jìn)行干預(yù)治療。

學(xué)者們從終板損傷的角度對(duì)椎間盤退行性變模型的建立進(jìn)行了一定的探索。Holm等[20］使用3.5 mm鉆頭損傷豬的腰椎終板，鉆頭尖部進(jìn)入髓核內(nèi)，3個(gè)月后纖維環(huán)前后部均發(fā)生退行性變，并且纖維環(huán)含水量和髓核蛋白多糖含量明顯減少，證實(shí)終板損傷可致椎間盤退行性變發(fā)生。該模型的缺點(diǎn)是終板損傷的同時(shí)髓核暴露于機(jī)體免疫系統(tǒng)，可能激發(fā)一系列自身免疫反應(yīng)，難以判斷椎間盤退行性變是由終板損傷還是髓核損傷引起。Iwahashi 等[21］通過被動(dòng)吸煙的方法誘導(dǎo)兔椎間盤退行性變，證實(shí)尼古丁可使椎體-終板附近血管芽的密度降低、管腔變窄，最終導(dǎo)致蛋白多糖和膠原的合成降低。Hutton 等[22］利用骨水泥阻斷一側(cè)或雙側(cè)軟骨終板的血供建立犬腰椎椎間盤退行性變模型，但經(jīng)過70 周的觀察，椎間盤并未出現(xiàn)退行性變，分析其原因?yàn)楣撬鄾]有注射到合適的部位，并沒有阻斷椎間盤的終板營養(yǎng)供給途徑，研究顯示，阻斷終板營養(yǎng)供應(yīng)途徑應(yīng)選擇在中央?yún)^(qū)，因?yàn)榻K板中央?yún)^(qū)和全部的纖維環(huán)對(duì)于小分子是滲透性的，而終板接近椎體周緣的外側(cè)區(qū)域是非滲透性的，滲透性得益于骨性終板血管芽的存在，而在終板中央?yún)^(qū)血管芽更為密集。上述研究證實(shí)，阻礙椎體-終板營養(yǎng)途徑可使椎間盤發(fā)生退行性變，但造模方法也存在明顯的不足，不能有效推廣應(yīng)用。

本研究嘗試通過終板下椎體內(nèi)注入醫(yī)用無水乙醇阻礙椎體-終板營養(yǎng)供應(yīng)途徑制作一種新的椎間盤退行性變動(dòng)物模型。無水乙醇注射入椎體后導(dǎo)致終板下血供障礙，首先出現(xiàn)終板退行性變，進(jìn)而影響椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)。組織學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，終板的生長板逐漸變薄，生長板是軟骨終板細(xì)胞密集排列的部位[23］，該部位變薄表明終板退行性變加重并逐漸喪失自我修復(fù)的能力。隨著終板結(jié)構(gòu)的退行性變、破壞，軟骨終板骨化程度增加，進(jìn)而椎間盤營養(yǎng)供給減少，髓核內(nèi)細(xì)胞數(shù)量及分泌的細(xì)胞外基質(zhì)也發(fā)生變化，髓核內(nèi)細(xì)胞增殖能力趨于降低，細(xì)胞也發(fā)生轉(zhuǎn)化，已有報(bào)道顯示髓核內(nèi)細(xì)胞從脊索細(xì)胞向軟骨樣細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化是椎間盤退行性變的表現(xiàn)[24-25］。通過對(duì)造模后椎間盤進(jìn)行影像學(xué)、形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察和檢測，結(jié)果顯示符合椎間盤自然退行性變過程，此模型適合于椎間盤退行性變的病因?qū)W研究，為未來臨床干預(yù)治療奠定了理論基礎(chǔ)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，ET-1 存在于發(fā)生退行性變的椎間盤終板中，并且被終板軟骨細(xì)胞分泌。注射無水乙醇后1 個(gè)月時(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ET-1 陽性表達(dá)，隨著終板退行性變加劇，軟骨終板細(xì)胞活性降低，后續(xù)ET-1表達(dá)下降。有研究[6］證實(shí)ET-1與人椎間盤終板退行性變相關(guān)。針對(duì)ET-1 在椎間盤退行性變中的作用，可嘗試在椎間盤退行性變的早期階段通過鄰近終板的椎體內(nèi)注射ET-1 受體阻斷劑以減弱或阻斷其作用，觀察是否延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤退行性變進(jìn)程，這為修復(fù)退行性變椎間盤開拓了新的方向。

受實(shí)驗(yàn)條件所限，本研究未對(duì)兔椎間盤退行性變過程中終板鈣化/骨化情況進(jìn)行具體評(píng)估。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將通過注射染料量化分析毛細(xì)血管閉塞情況與終板退行性變的相關(guān)性，并通過熒光標(biāo)記物追蹤小分子物質(zhì)的滲透能力，進(jìn)一步評(píng)估終板退行性變對(duì)椎間盤的影響。