不同毒株犬瘟熱病毒結(jié)構(gòu)基因的通用擴(kuò)增及序列測(cè)定

卜研，史一珺，薛向紅※，趙傳芳，陳杰，廉士珍，朱言柱，胡博

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.煙臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東 煙臺(tái) 264003）

犬瘟熱（canine distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）感染犬、狐、貉和水貂等多種肉食動(dòng)物而引起的一種急性熱性、高度接觸性傳染病[1]。該病發(fā)病率高，臨床癥狀多樣，感染后期容易繼發(fā)混合感染，死亡率高達(dá)30%～100%。近年來，CDV自然感染宿主不斷增多。隨著人類對(duì)犬、貓等寵物擁有數(shù)量的增多，犬瘟熱病毒在給動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)、生物多樣化帶來極大損失和危害的同時(shí)，還威脅著社會(huì)公共安全[2-3]。

CDV是副黏病毒科麻疹病毒屬成員，其基因組為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA。從基因組3'到5'端依次為3'端前導(dǎo)序列、核蛋白（N）基因、磷蛋白（P）基因、基質(zhì)蛋白（M）基因、融合蛋白（F）基因、血凝素蛋白（H）基因、聚合酶蛋白（F）基因和5'尾隨序列[4-5]。其中，H基因是變異率最高的，是CDV 野毒株分子流行病學(xué)調(diào)查的主要靶基因[6]?；贖基因的多樣性，CDV可分為Asia 1、Asia 2、Europe、European wildlife、America-2、Arctic和America-1 型（又稱疫苗型）。不同基因型犬瘟熱病毒均屬于一個(gè)血清型。我國流行毒株主要是Asia 1，但不同犬瘟熱病毒野毒對(duì)不同種屬易感動(dòng)物致病性差別較大，核苷酸序列存在較大差異，且同CDV-3、Lederle、Onderstepoort 等疫苗株的核苷酸序列同源率較低，為89%～90%。由于犬瘟熱病毒野毒株難以適應(yīng)Vero 細(xì)胞，且經(jīng)過細(xì)胞傳代后，存在毒力降低或丟失[7]。因此，學(xué)者們構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)犬瘟熱病毒受體-信號(hào)淋巴細(xì)胞激活因子（signalling lymphocyte activation molecule，SLAM）的Vero-SLAM細(xì)胞，大大提高了犬瘟熱病毒野毒的分離效率，因此成為目前分離犬瘟熱病毒的首選細(xì)胞[8-9]。但犬瘟熱病毒野毒分離株在Vero-SLAM細(xì)胞上連續(xù)傳代之后是否會(huì)發(fā)生毒力下降尚無報(bào)道。因此，為了快速、精準(zhǔn)獲得CDV 結(jié)構(gòu)基因序列，及時(shí)準(zhǔn)確地追溯犬瘟熱發(fā)病病源和開展CDV 遺傳進(jìn)化分析，本研究設(shè)計(jì)6 對(duì)特異性通用引物，分別對(duì)應(yīng)CDV 毒株的6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因區(qū)域，能夠同時(shí)擴(kuò)增CDV野毒和疫苗毒株，預(yù)測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)未知CDV結(jié)構(gòu)基因的有效擴(kuò)增。該擴(kuò)增體系的建立，還有助于明確CDV 野毒分離株適應(yīng)細(xì)胞前后，其結(jié)構(gòu)基因核苷酸水平和氨基酸水平變異情況，為人們探究CDV 致病機(jī)制、尋找關(guān)鍵毒力位點(diǎn)提供基礎(chǔ)，同時(shí)，也有望為核酸疫苗和亞單位疫苗研制，及反向遺傳學(xué)系統(tǒng)建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 犬瘟熱病毒野毒HBF-1 株、SD14（7）株，犬瘟熱病毒疫苗毒CDV-3株、OR12株、CDV/R-20/8株，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所疫病防控研究室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 GeneAmp PCR System 2700、Nanodrop 2000（ThermoFisher）；RNeasy Mini Kit（Qiagen）；SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis Super-Mix（Invitrogen）；質(zhì)粒小量提取試劑盒（Axygen）；2 TransStart?FastPfuPCRSuperMix（Transgen）；DNAMarker 15 000、DNA Marker 2 000（TaKaRa）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 中公布的23 個(gè)犬瘟熱病毒全基因組序列，具體毒株和GenBank 號(hào)如下：01-2689（AY649446）、007Lm/B（AB490680）、Onderstepoort（AF378705）、CDV SY（KJ466106）、LN（10）1（KP765764）、98-2654（AY466011）、00-2601（AY443350）、SD（14）7（KP765763）、HLJ1-06（JX681125）、98-2646（AY542312）、98-2645（AY445077）、CDV2784-2013（KF914669）、A75 17（AF164967）、Hebei（KC427278）、CDV-3（EU726268）、M25CR/H（AB490681）、50CBI/H（AB490678）、011C/H（AB490674）、PS（JN896331）、Snyder Hill（GU138403）、164071（EU716337）、CDVRD-JL（KJ848781）、CDV-ZC（KJ994343）。對(duì)上述所有毒株的各個(gè)結(jié)構(gòu)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用軟件Primer Premier 5.0 共設(shè)計(jì)6 對(duì)特異性通用引物（序列見表1），用于不同毒株犬瘟熱病毒各個(gè)結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增和序列測(cè)定，預(yù)期6 個(gè)目的條帶大小分別為1 620、1 614、1 048、2 009、1 894、6 600 bp。

1.2.2 不同毒株犬瘟熱病毒RNA提取 根據(jù)RNeasy Mini Kit 操作說明，對(duì)不同毒株犬瘟熱病毒的總RNA進(jìn)行提取。具體操作如下：取犬瘟熱病毒Vero 細(xì)胞培養(yǎng)液200μL，加入350μL RLT 使其充分裂解。之后加入等體積的70%乙醇，吹打混勻。取700μL加入到RN-easy spin column 中，置于 2 mL 收集管中，10 000 r/min 離心 15 s，棄流出液。700 μL Buffer RW1 到 RNeasy spin column 中，10000r/min離心15s，棄流出液。500μL Buffer RPE 到 RNeasy spin column 中，10 000 r/min 離心 15 s，棄流出液。500 μL Buffer RPE 到 RNeasy spin column中，10 000 r/min 離心 15 s，將 RNeasy spin column 置于新的2 mL 收集管中，全速離心1 min。將RNeasy spin column 置于新的1.5 mL 收集管中，在濾膜中間加入40 μL RNase free water 10 000 r/min 離心 1 min，洗脫獲得病毒細(xì)胞懸液的總RNA。

表1 犬瘟熱病毒6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因擴(kuò)增用通用引物序列Table 1 Universal primer sequences for amplification of six structural genes of CDV

1.2.3 不同毒株犬瘟熱病毒cDNA合成 利用Super-ScriptⅢFirst-Strand Synthesis SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以“1.2.2”中獲得的總RNA為模板5μL，50 mmol/L Oligo（dT）1 μL，50 ng/μL Random Hexamers 1μL，Annealing Buffer 1μL，混勻之后在 65 ℃孵育5 min，立即放冰上1 min。之后加入2 First-Strand Reaction Mix 10 μL 和 SuperscriptⅢ RNaseOut Enzyme Mix 2μL 吹打混勻，短離心，在50 ℃孵育50 min。

1.2.4 不同毒株犬瘟熱病毒各個(gè)結(jié)構(gòu)基因擴(kuò)增 根據(jù)普通 PCR 試劑盒 2 TransStart?FastPfu PCR SuperMix的說明操作，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)總體系50 μL包含以下組分：2 TransStart?FastPfu PCR SuperMix 25μL，上游引物 1μL，下游引物1μL，病毒cDNA2μL，ddH2O補(bǔ)齊至 50 μL。設(shè)定 PCR 程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，實(shí)際退火溫度（參照表1 中預(yù)先摸索好的不同引物對(duì)的退火溫度）20 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。取不同毒株犬瘟熱病毒的N、P、M、F、H 和L 基因的PCR產(chǎn)物5μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，判斷條帶大小，同時(shí)驗(yàn)證引物的特異性、通用性。

1.2.5 犬瘟熱病毒結(jié)構(gòu)基因序列測(cè)定 將野毒HBF-1株和疫苗毒CDV-3 株的6 個(gè)PCR 擴(kuò)增片段進(jìn)行凝膠回收后，所有片段連接至平端載體pEASY-Blunt，利用雙酶切鑒定出正確的重組子，送上海生工進(jìn)行片段序列測(cè)定，最后利用SeqMan進(jìn)行全長(zhǎng)拼接。將HBF-1 株的各個(gè)結(jié)構(gòu)基因序列與GenBank 公布的Hebei 株序列進(jìn)行同源性比對(duì)；將CDV-3 株的各個(gè)結(jié)構(gòu)基因序列與GenBank 公布的CDV-3 株序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.6 各個(gè)基因擴(kuò)增用引物對(duì)的特異性 為了明確各個(gè)基因擴(kuò)增用的引物對(duì)是否只能針對(duì)犬瘟熱病毒擴(kuò)增，對(duì)其他種類的犬源病毒（如犬細(xì)小病毒和犬II 型腺病毒）能否實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，以犬細(xì)小病毒和犬II 型腺病毒DNA 為模板，用之前摸索好的相同條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬瘟熱病毒各個(gè)結(jié)構(gòu)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用特異性通用引物（表1），對(duì)犬瘟熱病毒野毒HBF-1 株、SD14（7）株和犬瘟熱病毒疫苗毒CDV-3 株、OR12 株、CDV/R-20/8 株的 cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增。取 5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，篩選的6 對(duì)特異性通用引物能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)不同毒株的N、P、M、F、H 和L 基因特異性擴(kuò)增，而且獲得目的條帶大小，與預(yù)期一致（圖1～6）。

圖1 犬瘟熱病毒不同毒株N 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of N gene for different strains of CDV

圖2 犬瘟熱病毒不同毒株P(guān) 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of P gene for different strains of CDV

圖3 犬瘟熱病毒不同毒株M 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification of M gene for different strains of CDV

圖4 犬瘟熱病毒不同毒株F 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification of F gene for different strains of CDV

圖5 犬瘟熱病毒不同毒株H 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Amplification of H gene for different strains of CDV

圖6 犬瘟熱病毒不同毒株L 基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 Amplification of L gene for different strains of CDV

2.2 犬瘟熱病毒野毒HBF-1株各個(gè)結(jié)構(gòu)基因的序列測(cè)定

對(duì)犬瘟熱病毒野毒 HBF-1 株擴(kuò)增獲得的6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因片段，瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行膠回收純化。將片段連接至平端載體pEASY-Blunt 上，挑取陽性克隆子送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，每個(gè)堿基至少測(cè)序6 次以上，確保序列的準(zhǔn)確性。HBF-1 的各個(gè)結(jié)構(gòu)基因序列與2012 年 GenBank 公布的 Hebei 株的對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因序列進(jìn)行比對(duì)，由于HBF-1 是Hebei株在Vero-SLAM細(xì)胞上的適應(yīng)株，因此兩者的同源率高達(dá)99.8%～100%。此外，CDV 核苷酸序列具有高變性[10]。本研究設(shè)計(jì)的6 對(duì)引物，能針對(duì)犬瘟熱病毒野毒株HBF-1 的各個(gè)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行準(zhǔn)確擴(kuò)增，獲得6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因的準(zhǔn)確序列。

2.3 犬瘟熱病毒疫苗毒CDV-3株各個(gè)結(jié)構(gòu)基因的序列測(cè)定

對(duì)CDV-3 株病毒擴(kuò)增獲得的6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因片段，瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行膠回收純化。將片段連接至平端載體pEASY-Blunt 上，挑取陽性克隆子送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，每個(gè)堿基至少測(cè)序6 次以上，確保序列的準(zhǔn)確性。最后，獲得CDV-3 株的全基因組序列。與2012 年GenBank 公布的CDV-3 株各結(jié)構(gòu)基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源率高達(dá)99.3%。證實(shí)，本研究設(shè)計(jì)的6 對(duì)引物，能針對(duì)犬瘟熱病毒疫苗毒CDV-3 株的6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行準(zhǔn)確擴(kuò)增，獲得其準(zhǔn)確序列。

2.4 各個(gè)基因擴(kuò)增用引物對(duì)的特異性

以犬細(xì)小病毒和犬II 型腺病毒DNA 為模板，用之前摸索好的相同條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖7 所示。圖1～6 與圖7，互為陰陽性對(duì)照。

圖7 6對(duì)引物對(duì)犬細(xì)小病毒和犬II型腺病毒基因組的擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 Genome amplification of canine parvovirus and canine adenovirus type II by six pairs of primers

3 討論

近年來，犬瘟熱病毒自然感染宿主擴(kuò)大，多種野生動(dòng)物，甚至珍稀野生動(dòng)物有報(bào)道感染CDV 而發(fā)病、死亡[11]。學(xué)者們利用細(xì)胞傳代適應(yīng)法獲得了多株犬瘟熱病毒分離株，但是犬瘟熱病毒分離株在Vero 或Vero-SLAM細(xì)胞上連續(xù)傳代之后是否會(huì)發(fā)生毒力位點(diǎn)的突變，這些突變是否會(huì)影響病毒毒力下降尚無明確報(bào)道。因此，準(zhǔn)確獲得犬瘟熱病毒野毒株的6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因序列，對(duì)尋找關(guān)鍵毒力位點(diǎn)至關(guān)重要。另外，及時(shí)準(zhǔn)確地獲取不同毒株（甚至未知毒株）犬瘟熱病毒結(jié)構(gòu)基因序列，有利于分析犬瘟熱病毒遺傳進(jìn)化規(guī)律，追溯犬瘟熱病毒的可能來源。同時(shí)，可為核酸疫苗、亞單位疫苗和反向遺傳平臺(tái)的建立奠定基礎(chǔ)。

目前，針對(duì)犬瘟熱病毒各個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的基因擴(kuò)增有一些報(bào)道[12-13]，均是針對(duì)一種毒株的。犬瘟熱病毒可以感染很多宿主，實(shí)現(xiàn)跨種屬感染與傳播，犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株基因序列變異率較大，尤其是H 和F 基因序列。因此，為了提高科研效率、節(jié)省科研時(shí)間和避免資源浪費(fèi)，本研究設(shè)計(jì)并篩選出6 對(duì)特異性通用引物，一次性精確地實(shí)現(xiàn)了犬瘟熱病毒野毒和疫苗毒株6 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因的通用擴(kuò)增，對(duì)犬細(xì)小病毒和犬腺病毒均無擴(kuò)增，證明了6 對(duì)引物的通用性和特異性。擴(kuò)增過程中，可能因?yàn)椴≡０辶康牟煌嬖跀U(kuò)增亮度的稍微差異，可以通過增加擴(kuò)增體系，實(shí)現(xiàn)大量擴(kuò)增。HBF-1 是狐源犬瘟熱病毒野毒分離株[14]，OR12是犬瘟熱病毒貉體適應(yīng)株，可見，本研究設(shè)計(jì)的6 對(duì)通用引物能夠?qū)崿F(xiàn)不同宿主來源的犬瘟熱病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的有效擴(kuò)增。這大大提高了獲得不同毒株犬瘟熱病毒結(jié)構(gòu)基因序列的效率，縮短了獲得其他犬瘟熱病毒未知毒株結(jié)構(gòu)基因序列的時(shí)間。這有助于我們明確犬瘟熱野毒適應(yīng)細(xì)胞前后病毒各個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸序列變異情況，追溯CDV 變異來源和規(guī)律，有助于人類認(rèn)識(shí)犬瘟熱病毒野毒的致病機(jī)制，為尋找犬瘟熱病毒野毒關(guān)鍵毒力位點(diǎn)提供分子依據(jù)。同時(shí)，6 對(duì)引物的通用擴(kuò)增，為CDV結(jié)構(gòu)基因的重組構(gòu)建和反向遺傳平臺(tái)中輔助質(zhì)粒的構(gòu)建提供了便利。