熒光顯微鏡的成像原理及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

張宏宇

【摘? 要】本文詳述了幾種常見顯微鏡的原理，其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，以供參考。

【關(guān)鍵詞】熒光顯微鏡;原理;應(yīng)用

引言

熒光成像技術(shù)在生命科學(xué)研究中具有越來越廣泛的應(yīng)用前景。普通熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡一般應(yīng)用于組織、細(xì)胞的熒光成像;超分辨率顯微鏡則應(yīng)用于亞細(xì)胞器等微小結(jié)構(gòu)的成像，成像要求較高;而多光子激光掃描顯微鏡更多應(yīng)用于在體成像和離體厚組織樣本的成像。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，科研人員正確選擇合適的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，將有助于提高科研效率。

1熒光顯微鏡的原理

傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡是基于樣品的光吸收、相位梯度和雙折射等進(jìn)行成像，成像對比度低。熒光是當(dāng)分子受到光激發(fā)時(shí)，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，經(jīng)弛豫后再回到基態(tài)所輻射出的光。由于熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜與輻射光譜之間存在著斯托克斯位移，可采用濾光片濾出發(fā)射熒光。熒光顯微技術(shù)通過利用樣本發(fā)射熒光的特性對單個(gè)分子物質(zhì)的時(shí)空分布進(jìn)行成像，可顯著地提高成像對比度。此外，可特異性熒光標(biāo)記這一性能使得監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)部含特定熒光團(tuán)標(biāo)記成分的位置及其擴(kuò)散系數(shù)、轉(zhuǎn)運(yùn)特性、環(huán)境因素或與其他生物分子的相互作用等成為可能。常見的熒光標(biāo)記物質(zhì)主要有熒光染料、熒光蛋白和量子點(diǎn)等。其中，熒光蛋白作為活體熒光材料，具有良好的生物兼容性，被廣泛應(yīng)用于生物動態(tài)過程研究。

2激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)組成和原理

激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)包括激光光源，配備激發(fā)/抑制濾波器-分光器-光源/檢測針孔熒-檢測器的共聚焦掃描系統(tǒng)，配備微歩進(jìn)馬達(dá)的熒光顯微鏡、計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)和圖像存儲處理輸出系統(tǒng)。用于激發(fā)熒光的激光束透過激發(fā)針孔被分光器反射，通過顯微物鏡匯聚后入射于待觀察的標(biāo)本內(nèi)部焦點(diǎn)處。激光激發(fā)產(chǎn)生的熒光和少量反射激光一起被物鏡重新收集后送往分光器。由于分光器的分光作用，殘余的激光被分光器阻擋，不會被探測到。由于只有焦平面上的點(diǎn)所發(fā)出的光才能通過檢測針孔，因此焦平面上的觀察目標(biāo)點(diǎn)呈現(xiàn)亮色，而非觀察點(diǎn)則呈黑色背景，反差增加，圖像清晰。在成像過程中，檢測針孔的位置始終與顯微物鏡的焦點(diǎn)是一一對應(yīng)的（共軛），因而被稱為共聚焦顯微技術(shù)。光焦點(diǎn)在焦平面逐點(diǎn)逐行移動，將采集到的光信號直接傳輸?shù)娇刂齐娔X，經(jīng)光電信號轉(zhuǎn)換后，控制軟件可以把樣品焦平面光信號進(jìn)行虛擬成像，樣品表面光信號強(qiáng)度以灰度表示，也可以渲染上色，對圖像信息進(jìn)行更好的展示和分析。由于在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，加之去卷積技術(shù)可確保獲得更好的光學(xué)切片，分辨率提高了30%～40%，其光學(xué)切片性能使觀察微觀三維結(jié)構(gòu)成為可能總體來說，激光掃描共聚焦顯微鏡具有圖像采集、熒光信號定性和定位、熒光強(qiáng)度定量測定等基本功能。其中，圖像采集是熒光信號定位、定性和定量的基礎(chǔ)和前提。與其他光學(xué)成像技術(shù)相比，CLSM具有很多優(yōu)勢：無損傷掃描保持樣品的完整性、采集多重波段熒光、實(shí)現(xiàn)多種熒光信號的共定位分析、圖像質(zhì)量較高、操作控制靈活;定性和定位熒光物質(zhì)、定量測定熒光信號等。該技術(shù)被廣泛用于熒光定量測量、共焦圖象分析、三維圖象重建、活細(xì)胞動力學(xué)參數(shù)監(jiān)測和胞間通訊研究等方面，是生命科學(xué)、地球科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域新一代強(qiáng)有力的研究工具。

3超分辨率顯微鏡

3.1超分辨率顯微鏡工作原理

目前，超高分辨率成像的方法包括：結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)（SIM）、光敏定位顯微技術(shù)（PALM）、隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)（STORM）和受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)（STED）。SIM成像是在寬場熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，對樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)照明，利用照明后產(chǎn)生的莫爾條紋來提高分辨率。SIM通常是獲得一組圖片后進(jìn)行重構(gòu)，其分辨率可突破光學(xué)極限，提高到原來的兩倍（橫向分辨率約為100nm）。PALM和STORM技術(shù)則首先激發(fā)部分樣品的熒光信號，對其進(jìn)行分子定位，然后不斷循環(huán)該過程，得到不同的定位點(diǎn)最后進(jìn)行疊加為重構(gòu)的超高分辨率的圖像，STORM的分辨率可提高10倍（橫向分辨率約為20nm），有利于觀察到以往所不能觀察到的結(jié)構(gòu)。STED則利用一束激發(fā)光使熒光物質(zhì)發(fā)光的同時(shí)，用另外的高能脈沖激光器發(fā)射一束緊貼著的、波長較長的激光將第一束光斑大部分熒光物質(zhì)通過受激發(fā)射損耗過程淬滅，剩下的可激發(fā)熒光區(qū)被限制在小于衍射極限的區(qū)域內(nèi)，于是獲得一個(gè)小于衍射極限的光點(diǎn)。

3.2超分辨率顯微鏡特性

SIM技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是樣品處理與普通熒光標(biāo)記樣品處理相同，不足之處是成像分辨率有限，較共聚焦顯微鏡提高2倍。PALM和STORM成像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是分辨率有很大的提高，不足之處是成像過程中需要用到特殊的imagebuffer，樣品前處理較為復(fù)雜，對系統(tǒng)穩(wěn)定性要求高。STED技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是可以快速地觀察活細(xì)胞內(nèi)部實(shí)時(shí)變化的過程，在生命科學(xué)中應(yīng)用更為廣泛，其主要缺陷是設(shè)備昂貴，對系統(tǒng)穩(wěn)定性要求高。

3.3超分辨率顯微鏡應(yīng)用范圍

超分辨率顯微鏡的出現(xiàn)拓展了新的研究內(nèi)容，已逐漸應(yīng)用于觀察蛋白質(zhì)之間的組合關(guān)系來了解他們之間的相互作用，為后續(xù)的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究打下基礎(chǔ);也有利于研究分子之間的差異;還能用于在單分子水平上研究蛋白動態(tài)組裝的過程，揭示新的發(fā)現(xiàn)，有助發(fā)現(xiàn)更多的生命奧秘。

4熒光顯微鏡的應(yīng)用

采用搭建的熒光顯微鏡觀察腦組織切片，檢驗(yàn)系統(tǒng)的性能。生物樣品為Thy1-YFP（H）成年轉(zhuǎn)基因小鼠的腦切片，其中YFP主要表達(dá)在腦皮層的第5層及海馬區(qū)的錐形神經(jīng)元。YFP的峰值發(fā)射波長為529nm，與上述所選擇的濾光片套裝相匹配。

4.1大視場、低分辨率成像

首先使用低倍率物鏡進(jìn)行大視場觀察.采用4×、數(shù)值孔徑0.13的物鏡和10×目鏡組合所拍攝的小鼠腦組織冠狀切片熒光圖像，可見，其視場范圍可以涵蓋小鼠的整個(gè)半腦，但是成像空間分辨率低，僅僅能分辨神經(jīng)元胞體，對于更精細(xì)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)（例如樹突、軸突）則難以分辨。實(shí)驗(yàn)中可進(jìn)一步驗(yàn)證，僅通過對圖像進(jìn)行數(shù)字放大，無法提高成像的空間分辨率。

4.2小視場、高分辨率成像

將物鏡切換至高倍率、高數(shù)值孔徑物鏡，可實(shí)現(xiàn)小視場、高分辨率成像。數(shù)值孔徑0.5的物鏡和10×目鏡組合所拍攝的小鼠腦組織冠狀切片的熒光圖像數(shù)值孔徑0.5的物鏡和10×目鏡組合所拍攝的熒光圖像.相比較來說其視場范圍減小，但是，神經(jīng)元的樹突以及由軸突構(gòu)成的纖維束都清晰可見。

綜合上述實(shí)驗(yàn)可見，實(shí)際成像中需要在光學(xué)顯微系統(tǒng)中成像視場與空間分辨率之間進(jìn)行折中選擇。為了獲得高分辨率的圖像，成像視場往往受到限制;反之亦然。

結(jié)束語

文中所述各類型熒光顯微鏡有各自的特點(diǎn)，互相補(bǔ)充，可在成像清晰度、成像結(jié)構(gòu)精細(xì)度和成像深度等方面滿足科研工作的不同需求?？蒲腥藛T準(zhǔn)確理解各類型熒光顯微鏡的相關(guān)知識與應(yīng)用領(lǐng)域，有助于其正確選擇合適的儀器設(shè)備，提高科研水平，有助于提高貴重儀器的使用效益，減少資源浪費(fèi)。

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（作者身份證號碼：130204198208231812）