3-甲基丁醛對(duì)奶酪堅(jiān)果風(fēng)味的貢獻(xiàn)及其生物合成的研究進(jìn)展

陳 臣，周文雅，袁佳杰，于海燕，田懷香,*

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225004）

奶酪又名干酪，是指以牛奶、奶油、部分脫脂乳、酪乳或這些產(chǎn)品的混合物為原料加入凝乳酶，乳蛋白質(zhì)（主要是酪蛋白）凝固后，排除乳清，而制成的新鮮或發(fā)酵成熟的乳制品[1]。近年來，隨著人們健康意識(shí)及消費(fèi)水平的提高，我國奶酪行業(yè)也呈現(xiàn)快速增長趨勢(shì)，銷售額年均增速近30%[2]。但是從橫向?qū)Ρ葋砜矗覈壳澳汤胰司晗M(fèi)量僅有0.04 kg，僅為日韓的1/50[3]，未來奶酪市場(chǎng)發(fā)展空間潛力巨大。

盡管不同來源及品種的奶酪風(fēng)味存在差異，但總地來說，奶酪的風(fēng)味特征主要包括奶香味、堅(jiān)果味、肉湯味、硫味、酸味、鮮味、苦味、乳清味、水果味、脂肪酸味等[4]。在這些特征風(fēng)味中，成熟奶酪產(chǎn)生的“堅(jiān)果味”受到了國內(nèi)外，特別是受到中國消費(fèi)者的偏愛[5]。研究表明，支鏈醛，如2-甲基丁醛、3-甲基丁醛和2-甲基丙醛，具有堅(jiān)果/麥芽風(fēng)味，是許多硬質(zhì)和半硬質(zhì)奶酪中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物。在這3 種化合物中，因3-甲基丁醛的平均風(fēng)味閾值（在水溶液中為0.06 μg/mL）較另外兩者低[6]，對(duì)堅(jiān)果風(fēng)味貢獻(xiàn)較大而備受關(guān)注。

支鏈醛，尤其是3-甲基丁醛能賦予奶酪堅(jiān)果風(fēng)味，所以總結(jié)3-甲基丁醛對(duì)奶酪的風(fēng)味貢獻(xiàn)及其生物合成研究進(jìn)展，有助于闡明支鏈醛對(duì)于奶酪風(fēng)味的貢獻(xiàn)及奶酪堅(jiān)果味的形成機(jī)制，對(duì)于開發(fā)并生產(chǎn)符合中國人口味的奶酪具有很大的意義。本文在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上綜述了3-甲基丁醛對(duì)奶酪堅(jiān)果風(fēng)味的貢獻(xiàn)、生物合成途徑及其合成的調(diào)控措施，并展望了在研究3-甲基丁醛過程中所出現(xiàn)的問題以及未來的研究熱點(diǎn)。

1 3-甲基丁醛對(duì)奶酪風(fēng)味的貢獻(xiàn)

表1 富含3-甲基丁醛的奶酪總結(jié)Table 1 A summary of cheeses rich in 3-methylbutanal

支鏈醛是許多奶酪產(chǎn)品的特征香氣化合物（表1），其中3-甲基丁醛作為切達(dá)奶酪關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的研究已有諸多報(bào)道。早在2004年，Avsar等[17]通過描述性感官分析與定量測(cè)定揮發(fā)性香氣成分相結(jié)合的方法，確定了3 種支鏈醛（2-甲基丙醛、2-甲基丁醛和3-甲基丁醛）都是奶酪中產(chǎn)生堅(jiān)果風(fēng)味的主要化合物，其中3-甲基丁醛對(duì)堅(jiān)果風(fēng)味的貢獻(xiàn)最大。Christensen等[18]則利用分子蒸餾技術(shù)測(cè)定成熟3 年切達(dá)奶酪中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，通過香氣抽提物稀釋分析法發(fā)現(xiàn)3-甲基丁醛是成熟切達(dá)奶酪中的關(guān)鍵香氣化合物。研究表明3-甲基丁醛在切達(dá)奶酪中的最適含量是73～210 μg/kg[19]，在這個(gè)含量范圍內(nèi)其對(duì)奶酪的風(fēng)味貢獻(xiàn)是堅(jiān)果味，而且是均衡、理想的風(fēng)味。

除切達(dá)奶酪以外，在許多硬質(zhì)和半硬質(zhì)奶酪中，如格魯耶爾奶酪、藍(lán)紋奶酪、帕瑪森奶酪等，3-甲基丁醛都是重要的風(fēng)味化合物。Jo等[11]通過頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜的方法來分析高達(dá)奶酪的揮發(fā)性香氣化合物，發(fā)現(xiàn)3-甲基丁醛是高達(dá)奶酪的關(guān)鍵揮發(fā)性香味化合物之一，適量的3-甲基丁醛能賦予高達(dá)奶酪類似巧克力的風(fēng)味。Ayad等研究表明3-甲基丁醛在Proosdij型奶酪中也是一個(gè)主要風(fēng)味化合物，呈現(xiàn)出類似巧克力的風(fēng)味/堅(jiān)果風(fēng)味[12]。3-甲基丁醛不僅在西式奶酪中普遍存在，在中國傳統(tǒng)的一些奶酪中，3-甲基丁醛也對(duì)風(fēng)味產(chǎn)生貢獻(xiàn)。王蓓[14]、馬艷麗[15]等發(fā)現(xiàn)3-甲基丁醛在中式酸凝奶酪，例如在奶疙瘩、奶豆腐中，對(duì)其風(fēng)味也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。此外，馬楊[16]在測(cè)定新疆酸凝奶酪在成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化時(shí)，檢測(cè)到3-甲基丁醛的相對(duì)含量會(huì)隨著奶酪成熟而增加。

支鏈醛一般在奶酪成熟6～9 個(gè)月開始由氨基酸分解代謝產(chǎn)生，其含量隨著奶酪成熟時(shí)間的延長而增加[8]。Avsar等[17]發(fā)現(xiàn)切達(dá)奶酪只有在成熟時(shí)間大于9 個(gè)月時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生大量的3-甲基丁醛，Lazzi等[20]發(fā)現(xiàn)Grana Padano奶酪在成熟過程中，3-甲基丁醛含量顯著增加。Carunchia Whetstine等[21]發(fā)現(xiàn)與未成熟奶酪相比，成熟奶酪中其他風(fēng)味的存在（如硫味）會(huì)顯著增強(qiáng)支鏈醛對(duì)堅(jiān)果風(fēng)味的貢獻(xiàn)。盡管3-甲基丁醛被認(rèn)為對(duì)奶酪風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，但這并不意味著其含量越高越好，Yvon[22]和Smit[6]等均發(fā)現(xiàn)當(dāng)奶酪中支鏈醛的含量超過一定值時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致奶酪風(fēng)味的不均衡，甚至產(chǎn)生令人不愉快的不良風(fēng)味。因此，支鏈醛對(duì)奶酪風(fēng)味的貢獻(xiàn)仍需進(jìn)一步研究來確定。

2 3-甲基丁醛的合成途徑

奶酪中的3-甲基丁醛主要是由亮氨酸分解代謝產(chǎn)生的，包括兩個(gè)途徑：其一是亮氨酸在轉(zhuǎn)氨酶等的作用下分解代謝生成3-甲基丁醛，此途徑稱之為生物合成途徑；另一條途徑是亮氨酸通過化學(xué)降解生成3-甲基丁醛，此途徑稱之為Strecker降解途徑[8]。由于Strecker降解途徑需要在一定溫度下進(jìn)行，所以這一降解過程在奶酪中比較緩慢，奶酪中3-甲基丁醛的產(chǎn)生以生物合成途徑為主，以Strecker途徑為輔。

2.1 生物合成途徑

奶酪中3-甲基丁醛的生物合成途徑見圖1。首先，亮氨酸在氨基轉(zhuǎn)移酶（aminotransferase，AT）的作用下將氨基轉(zhuǎn)移給α-酮戊二酸產(chǎn)生α-酮異己酸和谷氨酸，其中α-酮異己酸是亮氨酸分解代謝的中心產(chǎn)物[23]，谷氨酸在谷氨酸脫氫酶的作用下重新合成α-酮戊二酸作為氨基受體[24]。生成的α-酮異己酸通過兩種代謝途徑產(chǎn)生3-甲基丁醛：1）直接途徑，α-酮異己酸通過α-酮酸脫羧酶（α-ketoacid decarboxylase，KADC）的非氧化性脫羧作用產(chǎn)生3-甲基丁醛[25]，例如已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的乳酸乳球菌IFPL730（Lactococcus lactisIFPL730）[26]和乳酸乳球菌乳脂亞種NIZO B1157[27]，就是利用直接途徑產(chǎn)生3-甲基丁醛；2）間接途徑，α-酮異己酸在α-酮酸脫氫酶（α-ketoacid dehydrogenase，KADH）的作用下生成異戊酰輔酶A，進(jìn)一步通過磷酸轉(zhuǎn)移酶和?；っ干僧愇焖?，最后在乙醛脫氫酶的作用下生成3-甲基丁醛[26]。已經(jīng)被證實(shí)的利用間接途徑產(chǎn)3-甲基丁醛的菌有瑞士乳桿菌CNRZ 32（Lactobacillus helveticus CNRZ 32）[24]和丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）[28]。生成3-甲基丁醛的微生物包括乳酸菌，例如乳球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬和肉食桿菌屬，此外，一些酵母菌，例如漢斯德巴氏酵母、耶氏解脂酵母等作為附屬發(fā)酵劑也會(huì)促進(jìn)奶酪中3-甲基丁醛的產(chǎn)生[12]。大部分微生物都是利用直接或者間接途徑生成3-甲基丁醛，然而值得注意的是，法國洛林Afzal等發(fā)現(xiàn)麥芽肉桿菌LMA 28[29]、Luo Jie等發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌乳酸亞種F9[30]均可以同時(shí)通過直接途徑和間接途徑兩種方式產(chǎn)生3-甲基丁醛。

圖1 3-甲基丁醛的生物合成機(jī)制[[8]]Fig. 1 Biosynthesis mechanism of 3-methylbutanal[8]

2.2 化學(xué)降解途徑（Strecker途徑）

從氨基酸到風(fēng)味化合物的另一個(gè)重要化學(xué)反應(yīng)是Strecker降解。通常，Strecker降解被描述為氨基酸的氨基與α-二羰基如還原糖的非酶、熱誘導(dǎo)的反應(yīng)，并且它是美拉德反應(yīng)中的重要步驟[31-32]。美拉德反應(yīng)始于氨基與還原糖的縮合，形成所謂的Amadori產(chǎn)物。這種Amadori產(chǎn)物的重排可形成二羰基化合物。這種二羰基與氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生風(fēng)味活性醛的過程稱為Strecker降解。然而，在高溫下，氨基酸的直接氧化脫羧也可產(chǎn)生相同的醛。這些反應(yīng)在高溫下尤其強(qiáng)烈，因此在很大程度上決定了烘焙產(chǎn)品的風(fēng)味。在較低溫度下，反應(yīng)也會(huì)繼續(xù)進(jìn)行，例如在奶酪和啤酒生產(chǎn)的情況下[33-34]。在亮氨酸存在的情況下，脫氨然后脫羧產(chǎn)生3-甲基丁醛，具體見圖2，溫度為主要控制參數(shù)，但底物濃度和底物特性也影響它們的轉(zhuǎn)化率；早在1957年，Keeney等[35]就已經(jīng)假定這個(gè)反應(yīng)可能會(huì)增加奶酪的風(fēng)味，因?yàn)榘被岷瓦€原糖可以在合適的環(huán)境中獲得，而且長時(shí)間的成熟條件，使反應(yīng)得以進(jìn)行。

圖2 亮氨酸的Strecker降解途徑[[36]]Fig. 2 Strecker degradation pathway of leucine[36]

3 調(diào)控3-甲基丁醛合成的研究進(jìn)展

鑒于3-甲基丁醛對(duì)奶酪風(fēng)味的重要性，眾多研究者提出了一些調(diào)控3-甲基丁醛生物合成的策略，主要包括以下幾種。

3.1 添加附屬發(fā)酵劑

通過將篩選到的乳酸乳球菌和工業(yè)菌種混合作為附屬發(fā)酵劑進(jìn)行切達(dá)的生產(chǎn)，3-甲基丁醛的含量可以顯著提高300～400 倍[37-38]；任發(fā)政教授團(tuán)隊(duì)將乳酸乳球菌乳酸亞種F9用于切達(dá)奶酪的生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)通過高濃度的菌種添加可以顯著提高3-甲基丁醛的含量[30]；將漢遜德巴利酵母D18335（Debaryomyces hansenii D18335）添加到奶酪生產(chǎn)過程中，檢測(cè)到奶酪中3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和2-甲基丙醛的含量都顯著提高[39]。此外，添加能夠產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株來誘導(dǎo)對(duì)細(xì)菌素敏感的發(fā)酵劑菌株發(fā)生裂解，使細(xì)胞內(nèi)的酶釋放出來，使其與底物反應(yīng)，也可以增加3-甲基丁醛的含量[40]。

3.2 添加前體物或輔因子

研究表明，通過添加3-甲基丁醛的前體物——亮氨酸，可以增加干酪凝乳中3-甲基丁醛的含量[36]；添加5-磷酸吡哆醛時(shí)，轉(zhuǎn)氨作用是氨基酸分解代謝的第一步，5-磷酸吡哆醛作為輔助因子用于催化轉(zhuǎn)氨酶的反應(yīng)[41]，能夠催化亮氨酸產(chǎn)生α-酮異己酸；添加α-酮戊二酸時(shí)，在沒有外源添加α-酮戊二酸的情況下，奶酪中的氨基酸轉(zhuǎn)氨作用相當(dāng)有限，因?yàn)棣?酮戊二酸對(duì)于氨基酸轉(zhuǎn)氨過程來說是必須的。通過向奶酪凝乳中添加α-酮戊二酸可以原位刺激轉(zhuǎn)氨作用，主要導(dǎo)致α-酮異己酸和α-羥基異己酸的含量增加，α-酮異己酸又進(jìn)一步地反應(yīng)生成3-甲基丁醛[42-43]。van de Bunt等[44]在只有亮氨酸和乳酸乳球菌B1157（L. lactis strain 1157）的溶液中加入α-酮戊二酸后，3-甲基丁醛含量顯著增加。

3.3 基因工程手段

α-酮異己酸是亮氨酸分解代謝的中心物質(zhì)，其除了可以通過直接和間接途徑生成3-甲基丁醛之外，還可以在α-羥基酸脫氫酶的氫化作用下產(chǎn)生α-羥基異己酸。但是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[23,29]，α-羥基異己酸是一種幾乎沒有任何風(fēng)味的化合物，所以使編碼α-羥基酸脫氫酶的基因panE失活[45]，會(huì)減少可用于脫羧和其他轉(zhuǎn)化的α-酮異己酸的分解，以達(dá)到增加3-甲基丁醛含量的目的[46]。

3.4 改變物理化學(xué)條件

細(xì)胞外氧化還原電位或氧氣對(duì)風(fēng)味的形成也能夠產(chǎn)生影響。通過增加溶解氧濃度或氧化劑，可以促進(jìn)奶酪中所需醛/醇的形成，該調(diào)控方式已被許多研究證實(shí)[47-49]。

3.5 其他

乳酸乳球菌處于支鏈氨基酸（如異亮氨酸）饑餓狀態(tài)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致3-甲基丁醛含量顯著升高[50-51]。支鏈氨基酸是全局調(diào)控因子CodY的效應(yīng)分子，CodY通過與其結(jié)合，調(diào)控不同基因的轉(zhuǎn)錄，改變碳、氮代謝流的走向，幫助細(xì)胞適應(yīng)營養(yǎng)匱乏的環(huán)境[52]。研究發(fā)現(xiàn)，在乳酸乳球菌中，CodY蛋白的結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)15 bp的回文序（AATTTTCNGAAAATT），稱為CodY-box[53]，在乳酸乳球菌的KADC基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)[46]。以上研究表明，全局調(diào)控因子CodY在3-甲基丁醛的生物合成調(diào)控中可能發(fā)揮著重要作用，然而其具體機(jī)制尚不明晰。

4 結(jié) 語

目前，雖然國內(nèi)外對(duì)支鏈醛尤其是3-甲基丁醛對(duì)奶酪的風(fēng)味貢獻(xiàn)及其生物合成有了一定的研究和了解，但仍然有許多問題有待解決。首先，香氣化合物在食品中的貢獻(xiàn)取決于多個(gè)因素：化合物的濃度、閾值、食品的基質(zhì)以及不同化合物的相互作用[54]。盡管不同研究已經(jīng)表明：合適濃度的3-甲基丁醛在奶酪中會(huì)產(chǎn)生令愉快的堅(jiān)果風(fēng)味，但是3-甲基丁醛對(duì)奶酪風(fēng)味影響因素的指標(biāo)尚未確定，包括3-甲基丁醛在奶酪中的閾值、合適的濃度范圍等。此外，Zhu Jiancai等[55]通過研究茶中風(fēng)味物質(zhì)的協(xié)同作用，發(fā)現(xiàn)3 種支鏈醛由于相似的結(jié)構(gòu)和香韻特征表現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用，然而這3 種支鏈醛之間，及其與其他化合物間對(duì)于奶酪堅(jiān)果風(fēng)味的協(xié)同作用鮮有研究。其次，盡管微生物生物合成3-甲基丁醛的兩種途徑已經(jīng)明確，奶酪體系中哪種合成途徑更加有效、奶酪不同成熟時(shí)期關(guān)鍵酶的表達(dá)如何變化、存在兩種途徑的微生物在兩種途徑的選擇機(jī)制和分工配合關(guān)系如何等尚未完全揭示。近年來，基于多組學(xué)技術(shù)從多維度全面解析奶酪發(fā)生在微生物菌群、基因、蛋白、生化反應(yīng)、風(fēng)味產(chǎn)物等層次上的時(shí)序變化，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行特定微生物的篩選和應(yīng)用為這些問題提供了全面的解決方案[56]。這些問題的解決，對(duì)于如何選擇合適的附屬發(fā)酵劑、調(diào)控支鏈醛的合成非常重要。最后，如前所述，3-甲基丁醛一般在奶酪成熟6～9 個(gè)月開始產(chǎn)生，為了獲得更佳的堅(jiān)果味的口感，往往需要很長的成熟時(shí)間。這不僅增加了產(chǎn)品的生產(chǎn)周期和成本，也不利于標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)。盡管不同的研究者通過各種方式調(diào)控3-甲基丁醛的生成，但目前效果仍不明顯，一個(gè)可能的原因就是忽略了轉(zhuǎn)錄調(diào)控在其中發(fā)揮的重要作用。因而需要在前人的研究基礎(chǔ)上，解析3-甲基丁醛的合成和調(diào)控機(jī)制，為通過生物手段調(diào)控3-甲基丁醛的合成奠定基礎(chǔ)。

隨著人們營養(yǎng)健康意識(shí)的增強(qiáng)及西式快餐、烘焙食品的發(fā)展，喜歡奶酪的人會(huì)越來越多，奶酪將成為我國乳制品行業(yè)中最具成長潛力的品類之一。鑒于口味是消費(fèi)者選擇食品的重要因素，開發(fā)適合中國口味的奶酪便成為提高國內(nèi)奶酪消費(fèi)、促進(jìn)國內(nèi)奶酪產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。因此，開發(fā)并生產(chǎn)強(qiáng)化堅(jiān)果風(fēng)味的奶酪具有很大的發(fā)展空間和潛力。3-甲基丁醛是奶酪成熟過程中產(chǎn)生的特征風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)奶酪堅(jiān)果風(fēng)味的形成具有重要影響。因此，通過全面研究3-甲基丁醛對(duì)奶酪堅(jiān)果風(fēng)味的貢獻(xiàn)，闡明支鏈醛對(duì)于奶酪風(fēng)味的貢獻(xiàn)及奶酪堅(jiān)果味的形成機(jī)制，對(duì)于開發(fā)生產(chǎn)更適合我國消費(fèi)者口味的奶酪，促進(jìn)我國原制奶酪產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型和升級(jí)具有重要的意義。