基于氣相色譜-質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)研究貯藏過程中灘羊肉脂肪代謝通路轉(zhuǎn)換

苑昱東，李子欣，羅瑞明*，劇 檸，尤麗琴

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

動(dòng)物屠宰放血后機(jī)體死亡，而器官、組織的機(jī)能并沒有同時(shí)停止，細(xì)胞仍在進(jìn)行各種生命活動(dòng)[1-3]。由于機(jī)體呼吸與血液循環(huán)中斷，細(xì)胞內(nèi)的各種需氧性生化反應(yīng)停止，代謝與活體產(chǎn)生差異[4-6]。研究宰后代謝差異對(duì)了解動(dòng)物宰后肉成熟機(jī)理、改進(jìn)冷鮮肉加工貯運(yùn)技術(shù)有著積極的指導(dǎo)作用。

目前，國(guó)內(nèi)宰后代謝研究多集中于某個(gè)基因調(diào)控某個(gè)通路變化，如顏新春等[7]研究了動(dòng)物脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）基因表達(dá)的調(diào)控，結(jié)果表明，生長(zhǎng)激素能明顯抑制FAS mRNA的豐度，從而影響動(dòng)物脂肪酸的沉積。胡洪等[8]研究了哺乳動(dòng)物丙二酰輔酶A（coenzyme A，CoA）的調(diào)控與表達(dá)，結(jié)果表明，丙二酰CoA受多種酶影響，對(duì)脂肪酸合成及分解進(jìn)行調(diào)控。以宰后細(xì)胞為特殊生命系統(tǒng)，研究當(dāng)前組學(xué)技術(shù)可檢出的全部代謝的構(gòu)成及相互作用鮮見報(bào)道。灘羊是寧夏優(yōu)勢(shì)特色畜種[9-11]，本實(shí)驗(yàn)以灘羊冷卻肉肌細(xì)胞為研究對(duì)象，以代謝組學(xué)研究宰后代謝物變化及其通路轉(zhuǎn)換，揭示灘羊宰后細(xì)胞代謝動(dòng)態(tài)演化及其通路轉(zhuǎn)換機(jī)制，為灘羊肉品質(zhì)控制提供理論指導(dǎo)。

段艷等[12]采用速溶劑萃取-耦合溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)法/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）/GC-嗅覺測(cè)量法分析德州扒雞風(fēng)味化合物，共鑒定出73 種成分，其中醛類15 種、酮類8 種，這些風(fēng)味物質(zhì)是由脂肪酸反應(yīng)生成的。王毅等[13]采用GC-MS研究了伊拉兔肉脂肪酸組成，結(jié)果表明，兔胴體內(nèi)主要脂肪酸有19 種，且各部位脂肪酸含量差異不顯著，其中，棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、油酸的積累含量占總含量的77%。本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS、液相色譜-MS聯(lián)用（liquid chromatograph-MS，LC-MS）技術(shù)相結(jié)合研究宰后皮下脂肪0～4 ℃貯藏中可檢測(cè)出的全部代謝物、代謝通路，及其厭氧呼吸條件下的相互關(guān)系及聯(lián)動(dòng)轉(zhuǎn)化，分析時(shí)間推移中代謝網(wǎng)絡(luò)變化。研究這些特性對(duì)了解灘羊肉的性質(zhì)、改善肉品質(zhì)，及指導(dǎo)冷鮮肉及其制品加工有著重要的作用。研究代謝途徑轉(zhuǎn)化的代謝機(jī)制對(duì)了解灘羊宰后代謝物與代謝酶種類、豐度變化、調(diào)控機(jī)理及小分子營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味物質(zhì)（或前體）生成提供科學(xué)依據(jù)，為冷鮮灘羊肉及其肉制品生產(chǎn)技術(shù)研發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)的原料為現(xiàn)宰殺的鹽池灘羊（6 月齡，公羊，10～15 kg），采自寧夏鹽池縣大夏牧場(chǎng)食品有限公司。

甲醇、吡啶、正己烷、O-甲基羥胺鹽酸鹽（純度97%）德國(guó)CNW公司；氯仿 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-2-氯苯丙氨酸 上海恒創(chuàng)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）儀、ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國(guó)Waters公司；Triple TOF 5600高分辨MS儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Pegasus 4D全二維氣相色譜飛行時(shí)間MS聯(lián)用儀（comprehensive two-dimensional gas chromatography/timeof-flight MS，GC×GC-TOF-MS） 美國(guó)LECO公司；DB-5MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm） 美國(guó)J & W Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

采集在0～4 ℃、相對(duì)濕度85%條件下貯藏的灘羊背最長(zhǎng)肌上部皮下脂肪400 mg，封裝于滅菌冷凍管中待用。采樣周期為4 d，即采樣時(shí)間點(diǎn)為貯藏0、4、8、12 d，每組樣本做8 個(gè)生物學(xué)平行[14]。

1.3.2 脂肪酸組成的測(cè)定

1.3.2.1 樣品前處理

采用GC-MS分析樣品前處理步驟：精密稱取30 mg/組樣本，放入1.5 mL的離心管中。依次加入兩顆小鋼珠，加入20 μL的內(nèi)標(biāo)（0.3 mg/mLL-2-氯-苯丙氨酸，甲醇配制）和600 μL預(yù)冷的甲醇-水溶液（4∶1，V/V），在－80 ℃冰箱中放置2 min。隨即放入研磨機(jī)中研磨（60 Hz、2 min），加入120 μL氯仿。再用冰水浴超聲提取10 min，4 ℃靜置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取300 μL的上清液裝入玻璃衍生瓶中。

采用LC-MS分析樣品前處理步驟：精確稱取30 mg/組樣本于1.5 mL離心管中，加入20 μL內(nèi)標(biāo)（0.3 mg/mLL-2-氯-苯丙氨酸，甲醇配制），加入400 μL甲醇-水溶液（4∶1，V/V）；加入兩顆小鋼珠，在－80 ℃冰箱中放置2 min后，放入研磨機(jī)中研磨（60 Hz、2 min）；冰水浴中超聲提取10 min；－20 ℃靜置30 min；4 ℃、13 000 r/min離心15 min，用注射器吸取150 μL上清液，使用0.22 μm的有機(jī)相針孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移到LC進(jìn)樣小瓶，－80 ℃保存。

1.3.2.2 GC-MS分析

采用GC×GC-TOF-MS儀進(jìn)行GC-MS分析。GC條件：DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm），載氣為純度不小于99.999%的高純氦氣，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口的溫度為260 ℃。進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣。

MS條件：電子轟擊離子源，離子源溫度220 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍：m/z30～600。

1.3.2.3 LC-MS分析

LC條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：45 ℃；流動(dòng)相：水（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）、乙腈（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL。

MS條件：樣品質(zhì)譜信號(hào)采集采用正負(fù)離子掃描模式。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將所得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件包，先采用無監(jiān)督的主成分分析來觀察各樣本之間的總體分布和整個(gè)分析過程的穩(wěn)定性，后用有監(jiān)督的偏最小二乘法分析區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，找到組間的差異代謝物。為防止模型過擬合，采用7 次循環(huán)交互驗(yàn)證和200 次響應(yīng)排序檢驗(yàn)的方法來考察模型的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 灘羊肉貯藏過程中與脂肪酸代謝相關(guān)的差異代謝物分析結(jié)果

采用GC-MS、LC-MS法篩選出灘羊肉貯藏過程中含有的飽和脂肪酸有花生酸、硬脂酸、棕櫚酸；n-3不飽和脂肪酸有二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）；n-6不飽和脂肪酸有花生四烯酸；n-9不飽和脂肪酸有油酸、反油酸，具體見表1、2。再結(jié)合差異代謝物平均表達(dá)量的變化在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找相關(guān)差異代謝通路，進(jìn)行代謝通路差異對(duì)比分析。

表 1 采用GC-MS篩選的冷鮮灘羊脂肪在貯藏過程中主要差異代謝物種類及平均表達(dá)量變化Table 1 Changes in average expression of major differential metabolites during storage of mutton fat determined by GC-MS

表2 采用LC-MS篩選的冷鮮灘羊脂肪貯藏過程中主要差異代謝物種類及平均表達(dá)量變化Table 2 Changes in average expression of major differential metabolites during storage of mutton fat determined by LC-MS

2.2 代謝通路差異性對(duì)比分析

采用GC-MS技術(shù)篩選出冷鮮灘羊脂肪貯藏4 d和0 d、8 d和4 d、12 d和8 d的差異代謝通路分別為104、108、69 條，而采用LC-MS技術(shù)篩選出的結(jié)果分別為18、31、15 條。由通路數(shù)量的變化可以看出，宰后冷鮮灘羊脂肪貯藏過程中，代謝通路的數(shù)量與種類隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢(shì)。取部分重要的P值小于0.05的差異代謝通路制得表3、4。

表3 采用GC-MS技術(shù)得到的冷鮮灘羊脂肪貯藏過程中主要差異代謝通路值對(duì)比Table 3 Comparison of -values of major differential metabolism pathways during storage of mutton fat determined by GC-MS

表4 采用LC-MS技術(shù)得到的冷鮮灘羊脂肪貯藏過程中主要差異代謝通路值對(duì)比Table 4 Comparison of -values of major differential metabolism pathways during storage of mutton fat determined by LC-MS

由表3可知，有關(guān)糖代謝的通路在0～4 d內(nèi)差異顯著，而氧化磷酸化通路則未表現(xiàn)活躍，有關(guān)脂肪酸生物合成的通路在此階段也差異不顯著，說明宰后機(jī)體內(nèi)很快處于缺氧狀態(tài)，但細(xì)胞仍試圖維持其ATP和宰前活體一樣處于一個(gè)較高水平，機(jī)體利用糖酵解代替氧化磷酸化而提供ATP以及利用磷酸肌酸和ADP的轉(zhuǎn)化補(bǔ)充ATP，于是構(gòu)成了一個(gè)宰后供能反應(yīng)體系[15-21]。在4～8 d內(nèi)，新增代謝通路主要集中在與脂肪酸、氨基酸的合成及降解的相關(guān)代謝通路上，如脂肪酸生物合成、部分氨基酸合成通路。如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路P值由4 d組與0 d組的1.83×10－1（P＞0.05）變?yōu)? d組與4 d組的2.12×10－6（P＜0.01），甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝在8 d組與4 d組時(shí)表現(xiàn)出明顯差異，其P值（P＝6.54×10－4＜0.01）較4 d組與0 d組的P值（P＝5.16×10－2＞0.05）有顯著變化（表4中未給出）。說明與第4天相比，部分氨基酸代謝通路、脂肪酸代謝通路在貯藏第8天時(shí)表達(dá)顯著。脂肪酸的生物合成通路在整個(gè)冷鮮貯藏12 d過程中僅在4～8 d活躍，這與差異代謝物中風(fēng)味物質(zhì)前體油酸、棕櫚酸、硬脂酸在8 d時(shí)出現(xiàn)一致。說明冷鮮貯藏至8 d時(shí)，與脂肪酸合成的相關(guān)代謝通路活性提高，在此期間產(chǎn)生大量風(fēng)味前體物質(zhì)[22-23]。

2.3 代謝通路演化分析結(jié)果

在冷鮮貯藏8 d時(shí)，脂肪酸生物合成通路、GnRH信號(hào)通路以及甘油磷脂代謝通路變得活躍。不飽和脂肪酸生物合成通路在整個(gè)冷鮮貯藏過程中亦呈現(xiàn)出由差異不顯著到差異顯著再到差異不顯著的變化過程。對(duì)照KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)脂肪酸合成、分解的代謝通路，將有關(guān)棕櫚酸、硬脂酸的合成總體路徑繪制成圖1。

圖1 脂肪酸生物合成通路中有關(guān)棕櫚酸、硬脂酸的合成路徑Fig. 1 Biosynthesis pathways of palmitic acid and stearic acid

再以棕櫚酸的具體合成為例，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)信息繪制棕櫚酸合成路徑（圖2）。

由圖2和表1、2可以發(fā)現(xiàn)，由GC-MS、LC-MS結(jié)果篩選出的3-羥基丁酸、3-氧代十六烷酸分別為棕櫚酸合成過程中的兩個(gè)前體物質(zhì)，其中3-羥基丁酸是由乙酰CoA及丙二酰CoA共同合成的。在0～4 d內(nèi)，3-羥基丁酸被消耗，并在一系列酶（如脂肪酸合成酶、烯酰還原酶及β-酮酰基合成酶等）的催化作用下逐步合成為3-氧代十六烷酸，故在此時(shí)段內(nèi)，3-羥基丁酸表達(dá)量下調(diào)，而3-氧代十六烷酸表達(dá)量上調(diào)，但此時(shí)并未轉(zhuǎn)化為棕櫚酸，所以棕櫚酸的相對(duì)含量無差異。隨后在4～8 d內(nèi)，3-氧代十六烷酸的相對(duì)含量無差異，棕櫚酸的合成并沒有受其前體物質(zhì)3-羥基丁酸表達(dá)量上調(diào)的影響，反而其相對(duì)含量下降。說明在4～8 d內(nèi)，棕櫚酸氧化分解過程活躍，可能是由于此時(shí)段，組織主要由脂肪酸氧化分解供能所致；而3-羥基丁酸的上調(diào)并未直接影響3-氧代十六烷酸的相對(duì)含量，這一過程可能是此時(shí)段催化合成3-氧代十六烷酸的相關(guān)酶活性降低所致。

圖2 棕櫚酸合成路徑Fig. 2 Biosynthesis pathway of palmitic acid

因此，丙二酰CoA是脂肪酸合成中的關(guān)鍵物質(zhì)，其在脂肪酸合成中作為重要的二碳單位提供者存在[24]。丙二酰CoA在脂肪酸合成過程中起關(guān)鍵作用，同時(shí)也是抑制脂肪酸氧化分解的物質(zhì)[25-28]。脂肪酸β氧化路徑在4～8 d差異顯著，說明此時(shí)脂肪酸氧化相關(guān)的代謝方式占主導(dǎo)地位。因此，可以推測(cè)出丙二酰CoA此時(shí)的含量較之前有所減少，其來源主要是由乙酰CoA經(jīng)乙酰CoA羧化酶的轉(zhuǎn)化，也間接說明了此時(shí)乙酰CoA羧化酶的活性降低。

而丙二酰CoA轉(zhuǎn)變?yōu)楸?[酰基-載體蛋白]后，分別經(jīng)由不同酶催化生成棕櫚酸、硬脂酸等脂肪的載體蛋白。這說明，在冷鮮貯藏4～8 d時(shí)段，機(jī)體能量處于相對(duì)較低水平，此時(shí)多種氧代?；厦敢约爸舅岷铣擅副患せ?，從而使得棕櫚酸、硬脂酸等脂肪酸合成通路開啟。此外，在冷鮮貯藏4～8 d時(shí)棕櫚油酸表達(dá)量上調(diào)，但棕櫚酸表達(dá)量下調(diào)，可以看出，雖然脂肪酸生物合成通路開啟，但由于在此時(shí)硬脂?；d體蛋白去飽和酶與脂肪酸合成酶及脂肪?；?[?；?載體-蛋白質(zhì)]硫酯酶的活性不同，硬脂?；d體蛋白去飽和酶將十六烷-[酰基-載體蛋白]轉(zhuǎn)化為十六烯?；?[酰基-載體蛋白]，從而進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成棕櫚油酸；這一假設(shè)過程也能解釋棕櫚酸表達(dá)量在4～8 d時(shí)下調(diào)的原因。

圖3 GnRH信號(hào)通路中脂肪酸的β氧化路徑Fig. 3 β-Oxidation pathway of fatty acids in the GnRH signaling pathway

GnRH信號(hào)通路中有關(guān)脂肪酸β氧化路徑繪制如圖3所示，其中，環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）對(duì)細(xì)胞許多代謝過程的調(diào)節(jié)是通過調(diào)節(jié)酶的活性來實(shí)現(xiàn)的[29-31]。在有ATP存在的條件下，cAMP通過蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）激活脂肪蛋白激酶，使脂肪水解關(guān)鍵酶——激素敏感性甘油三酯脂肪酶磷酸化而激活，從而促進(jìn)脂肪水解為甘油和游離脂肪酸。而過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatorsactivated receptor α，PPAR-α）則在能量缺乏的條件下被激活，PPAR-α的激活是通過作用于脂肪酸，使其平均表達(dá)量上調(diào)，再結(jié)合、活化過氧化物酶體和線粒體脂肪酸β氧化的基因參與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)一步促進(jìn)脂肪酸的生成、利用和分解代謝。

經(jīng)上述分析可知，與脂肪酸代謝的相關(guān)通路均在冷鮮貯藏8 d時(shí)變得活躍，原因可能是經(jīng)過一段時(shí)間的冷鮮貯藏后，脂肪細(xì)胞外部環(huán)境發(fā)生變化，其能量水平較活體時(shí)較低，導(dǎo)致部分酶活性降低或失活而另一部分酶被激活，從而使得一部分代謝通路由無差異到差異顯著[32-34]。由圖1、2可知，脂肪酸生物合成通路中棕櫚酸和硬脂酸的合成路徑與GnRH信號(hào)通路中脂肪酸β氧化路徑同時(shí)開啟，又因在冷鮮貯藏8 d時(shí)，棕櫚酸、硬脂酸等差異代謝物平均表達(dá)量顯著下調(diào)，說明脂肪酸的合成要遠(yuǎn)小于其發(fā)生β氧化的程度。說明在貯藏初期，脂肪酸合成通路并未表現(xiàn)出現(xiàn)差異，但有關(guān)棕櫚酸等脂肪酸合成的前體短碳鏈化合物的相對(duì)含量有所變化。

3 結(jié) 論

本研究采用GC-MS、LC-MS技術(shù)研究宰后脂肪細(xì)胞0～4 ℃貯藏中可檢測(cè)出的全部代謝物、代謝通路，從代謝層面了解了宰后代謝的整體變化情況。結(jié)果表明，兩種方法下測(cè)出的差異代謝物結(jié)果有互補(bǔ)作用，檢測(cè)出的差異代謝通路從宏觀角度反映出了宰后整個(gè)代謝趨勢(shì)的變化。糖酵解通路在0～4 d內(nèi)活躍，這種現(xiàn)象反映了宰后機(jī)體立即進(jìn)入無氧呼吸階段，組織內(nèi)細(xì)胞還要維持正常能量代謝水平的這種應(yīng)激機(jī)制。在4～8 d內(nèi)，脂肪酸生物合成通路、GnRH信號(hào)通路開啟，乙酰CoA在乙酰CoA羧化酶的催化下轉(zhuǎn)換為丙二酰CoA，丙二酰CoA在脂肪酸生物合成通路的作用是二碳單位提供者，同時(shí)也起到抑制脂肪酸β氧化的作用，該酶將丙二酰CoA轉(zhuǎn)換為丙二酰-[酰基-載體蛋白]后又經(jīng)多種氧代?；讣爸舅岷铣擅复呋勺貦八?、硬脂酸、油酸等風(fēng)味前體物質(zhì)。8 d后，大部分通路逐漸關(guān)閉、消失，此時(shí)直接調(diào)控代謝的酶已失去活性。這個(gè)由能量變化引起的代謝通路之間的轉(zhuǎn)換過程可以看作是宰后代謝通路的動(dòng)態(tài)演化過程。由脂肪酸代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)前體也隨代謝活動(dòng)的開啟、活躍、消失這一演化過程而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。