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    孔石莼多糖鋅結(jié)構(gòu)表征與體外降血糖活性

    2020-04-25 05:02:28湯陳鵬王蓉琳
    食品科學(xué) 2020年7期
    關(guān)鍵詞:剛果紅樣液糖苷酶

    湯陳鵬,呂 峰*,王蓉琳

    (福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002)

    孔石莼(Ulva pertusa)又稱(chēng)海菠菜、海條等,是一種隸屬于石莼科的大型綠藻;其風(fēng)味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富,具有清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)等功效[1]??资欢嗵鞘强资恢械闹饕锘钚晕镔|(zhì)[2],有關(guān)研究表明,孔石莼多糖具有降血糖[3]、抗氧化[4]、降血脂[5]、抗腫瘤[6]等多種生物活性。

    鋅是人體必需的微量元素之一[7],在體內(nèi)酶和受體功能的調(diào)節(jié)中起著重要的作用[8]。缺鋅可導(dǎo)致人體營(yíng)養(yǎng)不良、皮膚炎癥、免疫力低下等一系列癥狀。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究表明,將天然多糖與鋅進(jìn)行絡(luò)合改性制備得到多糖鋅絡(luò)合物,與常見(jiàn)的無(wú)機(jī)補(bǔ)鋅劑相比,其生物利用率高、副作用小,且同時(shí)兼具多糖與鋅的生理功能,具有廣闊的應(yīng)用前景[9]。目前已見(jiàn)報(bào)道的多糖鋅有酵母多糖鋅[10]、夏枯草多糖鋅[11]、竹蓀多糖鋅[12]、大米胚芽多糖鋅[13]、金針菇多糖鋅[14]等。

    本研究以實(shí)驗(yàn)室自制的孔石莼多糖為參照,對(duì)孔石莼多糖鋅絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)與體外降血糖活性進(jìn)行表征與探究,以期為孔石莼資源的高值化利用和新型多糖補(bǔ)鋅劑的開(kāi)發(fā)提供一定的理論參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    孔石莼多糖、孔石莼多糖鋅(鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.24%),均為福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院保鮮基地實(shí)驗(yàn)室自制[15]。

    α-葡萄糖苷酶(比活力50 U/mg)、α-淀粉酶(豬胰腺,比活力10 U/mg)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG)上海源葉生物科技有限公司;硫酸、剛果紅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、可溶性淀粉、苯酚、氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    BSA223S分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;PHB-3 pH計(jì) 上海三信儀表廠;SYNERGY酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司;HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱、5500原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)、7890A氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;OHpak SB-806M HQ凝膠色譜柱 日本Shodex公司;DAWN HELEOS-II多角度激光光散射檢測(cè)器、OPtilab rex示差折光檢測(cè)器 美國(guó)Wyatt技術(shù)公司;UV2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津儀器設(shè)備公司;Nicolet IS50傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher科技公司;X’ pert3 and Empyrean X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)儀 荷蘭Panalytical公司;Nova NanoSEM 230場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM) 美國(guó)FEI公司。

    1.3 方法

    1.3.1 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征

    1.3.1.1 孔石莼多糖的單糖組成分析

    采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatographymass spectrometer,GC-MS)儀對(duì)孔石莼多糖的單糖組成進(jìn)行分析,樣品的酸解糖腈乙?;苌磻?yīng)參考呂明霞[16]的研究。色譜條件為色譜柱:HP-INNOWAX(30 m×0.32 mm,0.25 μm);載氣:N2;程序升溫:起始溫度190 ℃,2 ℃/min升至240 ℃后保持8 min,再以10 ℃/min升至260 ℃,保持2 min。質(zhì)譜條件為:電子轟擊電離(70 eV),離子源溫度200 ℃,接口溫度250 ℃,掃描范圍:m/z 30~600。

    1.3.1.2 總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

    孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物總糖含量的測(cè)定參考馮學(xué)珍等[17]的苯酚-硫酸法,并略作修改。繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算得到回歸方程,y=0.005 9x+0.025 5(R2=0.992 8),其中x為葡萄糖含量,y為溶液吸光度。

    分別量取孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物樣液2.0 mL,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的苯酚溶液1.0 mL、濃硫酸5.0 mL,充分混勻,靜置冷卻30 min后,于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度,根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線與吸光度計(jì)算得到兩者的總糖含量。

    1.3.1.3 凝膠滲透色譜-多角度激光光散射-示差檢測(cè)器聯(lián)用法分析

    采用凝膠滲透色譜-多角度激光光散射-示差檢測(cè)器體系(gel permeation chromatography-multi-angle laser light scattering-refractive index,GPC-MALLS-RI)對(duì)孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的分子特征參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)[18-19]。色譜條件為色譜柱:OHpak SB-806M HQ;流動(dòng)相:0.1 mol/L NaCl;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:200 μL;樣品質(zhì)量濃度:1 mg/mL。

    1.3.1.4 剛果紅實(shí)驗(yàn)

    采用剛果紅實(shí)驗(yàn)分析孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的螺旋構(gòu)象[20]。將孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物分別配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的待測(cè)樣液,分別與等體積的80 μmol/L剛果紅溶液混勻后,加入1 mol/L NaOH溶液,梯度調(diào)節(jié)混合溶液中NaOH的濃度為0~0.50 mol/L,濃度梯度為0.05 mol/L,并測(cè)定各個(gè)NaOH濃度下混合溶液的最大吸收波長(zhǎng);空白對(duì)照以相同體積的蒸餾水取代待測(cè)樣液,配制同樣濃度NaOH的剛果紅溶液,并測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)。

    1.3.1.5 紫外-可見(jiàn)光譜分析

    分別稱(chēng)取適量孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物樣品粉末,均配制成1 mg/mL的溶液,采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行掃描,對(duì)兩者的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行初步表征,掃描范圍為200~800 nm[21]。

    1.3.1.6 傅里葉變換紅外光譜分析

    分別稱(chēng)取2 mg孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物樣品粉末,與適量溴化鉀粉末混合、研磨并壓制成薄片,使用傅里葉變換紅外光譜儀在400~4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[22],探究孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的官能團(tuán)特征。

    1.3.1.7 XRD分析

    采用XRD儀研究孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)狀態(tài)[23]。XRD條件為:管壓45 kV,管流40 mA,陽(yáng)極為Cu靶,最小步長(zhǎng)0.001°,發(fā)散狹縫0.76 mm,掃描速率5°/min。

    1.3.1.8 SEM觀察

    分別稱(chēng)取一定量的孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物樣品粉末,粘著于樣品臺(tái)上,置于真空噴鍍儀內(nèi)鍍導(dǎo)電膜,使用SEM對(duì)孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的表面形貌進(jìn)行觀察[24]。

    1.3.1.9 AFM觀察

    分別配制質(zhì)量濃度為10 μg/mL的孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物溶液,各取5 μL樣液滴于新剝離的云母片表面,靜置,待其風(fēng)干后采用AFM通過(guò)輕敲模式對(duì)兩者分子的微觀形貌進(jìn)行觀測(cè)[25]。

    1.3.2 孔石莼多糖鋅體外降血糖活性測(cè)定

    1.3.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制能力測(cè)定

    參考陳浩[26]的實(shí)驗(yàn)方法,稍作修改。取孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物分別配制成質(zhì)量濃度依次為5、10、15、20、25 mg/mL的待測(cè)樣液;采用100 mmol/L、pH 6.8的磷酸鈉緩沖液分別配制5 mmol/L的PNPG溶液與0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。分別移取50 μL待測(cè)樣液于96 孔板孔中,各加入50 μL PNPG溶液,于37 ℃下溫孵10 min,各加入50 μL α-葡萄糖苷酶溶液,置于酶標(biāo)儀中37 ℃反應(yīng)30 min后,于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度A1。以等體積蒸餾水取代待測(cè)溶液,測(cè)定其吸光度A0;以等體積磷酸鈉緩沖液取代α-葡萄糖苷酶溶液,測(cè)定其吸光度A2,以等體積蒸餾水和磷酸鈉緩沖液分別取代待測(cè)溶液和α-葡萄糖苷酶溶液,測(cè)定其吸光度A3。用式(1)計(jì)算抑制率。

    1.3.2.2 α-淀粉酶抑制能力測(cè)定

    采用DNS比色法[27]進(jìn)行檢測(cè),并略作修改。將孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物分別配制成質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25 mg/mL的待測(cè)樣液;采用25 mmol/L、pH 6.9的磷酸鹽緩沖液分別配制10 U/mL的α-淀粉酶溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的可溶性淀粉溶液。向各試管中分別加入300 μL不同質(zhì)量濃度的待測(cè)溶液及300 μL的α-淀粉酶溶液,混合均勻,于37 ℃下溫孵15 min,再分別加入300 μL可溶性淀粉溶液開(kāi)始反應(yīng),15 min后再各加入500 μL DNS試劑顯色,并立即煮沸滅酶10 min終止反應(yīng);將混合體系定容至10 mL,于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度A1。以等體積蒸餾水取代待測(cè)溶液,測(cè)定其吸光度A0;以等體積磷酸鹽緩沖液取代α-淀粉酶溶液,測(cè)定其吸光度A2,以等體積蒸餾水和磷酸鹽緩沖液分別取代待測(cè)溶液和α-淀粉酶溶液,測(cè)定其吸光度A3。用式(2)計(jì)算抑制率。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

    采用DPS V7.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,各數(shù)據(jù)之間的多重比較使用最小顯著性差異法,其中,以P>0.05為差異不顯著,P<0.05為顯著,P<0.01為極顯著。使用Microsoft Excel 2007軟件繪圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征

    2.1.1 孔石莼多糖的單糖組成分析結(jié)果

    采用GC-MS分析孔石莼多糖的單糖組成(圖1),通過(guò)與單糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間與離子碎片進(jìn)行對(duì)比,確定孔石莼多糖是由鼠李糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的雜多糖,其構(gòu)成單糖基的物質(zhì)的量比為1.00∶0.06∶0.93∶0.45∶2.29∶0.07。

    圖1 標(biāo)準(zhǔn)單糖(a)與孔石莼多糖(b)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of monosaccharide standards (a) and Ulva pertusa polysaccharides (b)

    2.1.2 總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

    苯酚-硫酸法測(cè)定孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的總糖含量。經(jīng)計(jì)算,孔石莼多糖和孔石莼多糖鋅中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為53.35%和49.40%,可以看出經(jīng)過(guò)絡(luò)合鋅改性,孔石莼多糖中的總糖含量有所下降。

    2.1.3 GPC-MALLS-RI分析結(jié)果

    表1 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的分子特征參數(shù)Table 1 Molecular parameters of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

    表1數(shù)據(jù)顯示,孔石莼多糖鋅的重均分子質(zhì)量(Mw)為1.319×105g/mol,重均均方根旋轉(zhuǎn)半徑(Rw)為28.6 nm,均明顯低于孔石莼多糖的Mw(4.903×105g/mol)和Rw(35.6 nm),而多分散指數(shù)(Mw/Mn)為2.120,明顯高于孔石莼多糖的(1.607)。該結(jié)果說(shuō)明經(jīng)過(guò)絡(luò)合鋅反應(yīng),孔石莼多糖鋅的分子質(zhì)量、分子尺寸明顯減小,而分子質(zhì)量分布則較原多糖變寬,與Wei Dongfeng等[28]在制備紅芪多糖硒絡(luò)合物時(shí)得到的結(jié)果相似,推測(cè)可能是制備時(shí)反應(yīng)體系使用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值,由于鹽酸為強(qiáng)酸,故導(dǎo)致絡(luò)合反應(yīng)過(guò)程中部分多糖發(fā)生了降解。

    圖2 孔石莼多糖(a)及其鋅絡(luò)合物(b)的空間構(gòu)象Fig. 2 Spatial conformation of Ulva pertusa polysaccharides (a) and polysaccharides-zinc complex (b)

    圖2 為孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的分子質(zhì)量與均方根旋轉(zhuǎn)半徑之間的關(guān)系曲線圖,可顯示樣品的多糖鏈構(gòu)象[29]。從圖2中可看出,孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的譜圖線性關(guān)系均較差,兩者均呈類(lèi)似U型的曲線,提示兩者的分子構(gòu)象均為高支化度結(jié)構(gòu),該現(xiàn)象與曾紅亮[30]對(duì)金柑多糖的GPC-MALLS-RI分析結(jié)果類(lèi)似。

    2.1.4 剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    圖3 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物與剛果紅反應(yīng)體系的最大吸收波長(zhǎng)Fig. 3 Congo-red reactions of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

    剛果紅能夠與具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),與剛果紅溶液相比,絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移,并在一定的NaOH濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)亞穩(wěn)性[31]。從圖3中可看出,剛果紅與孔石莼多糖混合后,其最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生了明顯的紅移,且在NaOH濃度0.15~0.50 mol/L范圍內(nèi)無(wú)明顯變化,出現(xiàn)了亞穩(wěn)區(qū),而剛果紅與孔石莼多糖鋅混合溶液的最大吸收波長(zhǎng)則沒(méi)有出現(xiàn)這種特征的明顯變化。由此可推測(cè)孔石莼多糖具有三螺旋結(jié)構(gòu),而其鋅絡(luò)合物中的孔石莼多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)基本被破壞。

    2.1.5 紫外-可見(jiàn)光譜分析結(jié)果

    圖4 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig. 4 UV-VIS spectra of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

    由圖4可知,兩條曲線在260、280 nm波長(zhǎng)處均無(wú)吸收峰,且孔石莼多糖鋅在紫外區(qū)的吸收強(qiáng)度明顯小于孔石莼多糖,說(shuō)明孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物均基本不含有核酸和蛋白質(zhì),且絡(luò)合物中的生色基或助色基與Zn2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)[32],形成了化學(xué)鍵束縛,從而導(dǎo)致紫外吸收強(qiáng)度有所減弱。

    2.1.6 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

    由圖5可知,孔石莼多糖在2 981.46 cm-1處的峰為甲基(—CH3)中C—H非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)的吸收峰,1 621.20 cm-1處的峰為羧基(—COO-)中C=O非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)的吸收峰,1 230.86 cm-1處的峰為硫酸基(—OSO3-)中S=O的伸縮振動(dòng)峰;經(jīng)過(guò)絡(luò)合鋅反應(yīng),這3 處峰分別移動(dòng)至2 992.55 、1 632.91、1 215.40 cm-1處,提示絡(luò)合鋅改性對(duì)孔石莼多糖的這些基團(tuán)造成了一定的影響;此外,圖4還顯示,孔石莼多糖鋅在1 391.89 cm-1與997.03 cm-1處較其原多糖多出兩個(gè)特征峰。綜上可知,孔石莼多糖絡(luò)合鋅的反應(yīng)主要體現(xiàn)在其糖鏈上的—COO-、—CH3、—OSO3-等基團(tuán)與Zn2+發(fā)生反應(yīng),而非簡(jiǎn)單的物理混合。

    圖5 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的傅里葉變換紅外光譜Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

    2.1.7 XRD分析結(jié)果

    圖6 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的XRD圖Fig. 6 X-ray diffraction patterns of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

    從圖6中可看出,孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物均只在20°左右存在一不明顯的包峰,且多糖鋅的包峰強(qiáng)度高于原多糖的,但并未發(fā)現(xiàn)硫酸鋅的特征衍射峰,提示二者均為無(wú)定形結(jié)構(gòu),同時(shí)再次證明孔石莼多糖與Zn2+確實(shí)發(fā)生了絡(luò)合作用,推測(cè)Zn2+可能均勻地分散在孔石莼多糖的糖鏈上,生成絡(luò)合物。

    2.1.8 SEM觀察結(jié)果

    從圖7a1、b1中可發(fā)現(xiàn)孔石莼多糖與其鋅絡(luò)合物均呈層疊堆積的片狀,表面較為平整,但兩者的形貌均無(wú)規(guī)整性,參考相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果,推測(cè)該現(xiàn)象可能是由于分子鏈之間互相交聯(lián)聚集形成的[33-34],提示兩樣品的分子間均存在很強(qiáng)的相互作用,且均呈無(wú)定形結(jié)構(gòu),與XRD分析中得到的結(jié)果相符;此外,兩者均含多孔的蜂巢狀結(jié)構(gòu),這可能是凍干過(guò)程中冰晶升華而形成。通過(guò)對(duì)比圖7a2與b2,可發(fā)現(xiàn)孔石莼多糖表面較為光滑、緊密,而其鋅絡(luò)合物則較為粗糙,存在許多龜裂,兩者表面均存在一些較小的碎屑狀顆粒,但孔石莼多糖鋅表面的顆粒物明顯多于孔石莼多糖,由此亦可推斷,孔石莼多糖除了與Zn2+之間發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)外,還可能存在物理吸附現(xiàn)象。

    圖7 孔石莼多糖(a)及其鋅絡(luò)合物(b)在不同放大倍數(shù)下的SEM圖Fig. 7 SEM images of Ulva pertusa polysaccharides (a) and polysaccharides-zinc complex (b)

    2.1.9 AFM分析結(jié)果

    圖8 孔石莼多糖(a)及其鋅絡(luò)合物(b)在AFM下的照片F(xiàn)ig. 8 Atomic force microscopic images of Ulva pertusa polysaccharides (a)and polysaccharides-zinc complex (b)

    由圖8可知,孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物分子鏈的大小、形狀均不均等,呈山峰狀、鏈狀顆粒,兩樣品的分子鏈寬度在幾十至幾百納米不等,明顯大于天然多糖分子鏈的寬度(0.1~1 nm),證明兩樣品的分子均是由多股糖鏈互相交聯(lián)纏結(jié)形成的聚集體,該現(xiàn)象與Wang Kaiping等[35]的研究結(jié)果相似;對(duì)比兩者的譜圖還可看出,孔石莼多糖分子聚集體整體分布相對(duì)較為均勻,高度約為1~2 nm左右,體積較??;而孔石莼多糖鋅分子聚集體明顯較原多糖的大,且整體分布參差不齊,聚集體高度分布在2~7 nm范圍,體積較大,此現(xiàn)象與黃靖等[23]在觀察肉蓯蓉多糖鋅絡(luò)合物時(shí)得到的相似,提示經(jīng)過(guò)絡(luò)合改性,孔石莼多糖分子的團(tuán)聚性增強(qiáng)。

    2.2 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的體外降血糖活性

    2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制能力測(cè)定結(jié)果

    圖9 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig. 9 Inhibitory effects of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex on α-glucosidase

    如圖9所示,孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物樣液均在質(zhì)量濃度大于5 mg/mL時(shí)才體現(xiàn)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性,且兩者的抑制率均隨質(zhì)量濃度的增加而極顯著增大(P<0.01)。相同質(zhì)量濃度下,孔石莼多糖鋅的抑制率顯著或極顯著大于原多糖(P<0.05或P<0.01)。當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí),孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物樣液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率均達(dá)到最大值,分別為(26.64±0.95)%、(54.66±1.20)%。經(jīng)計(jì)算,兩者抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分別為42.87、23.63 mg/mL;IC50越小,抑制能力越強(qiáng),可知同條件下,孔石莼多糖鋅樣液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力是孔石莼多糖樣液的1.81 倍。

    2.2.2 α-淀粉酶抑制能力測(cè)定結(jié)果

    圖10 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物對(duì)α-淀粉酶的抑制效果Fig. 10 Inhibitory effects of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex on α-amylase

    從圖10中可以看出,相同質(zhì)量濃度下,孔石莼多糖鋅的抑制率極顯著大于原多糖(P<0.01)??资欢嗵羌捌滗\絡(luò)合物樣液對(duì)α-淀粉酶的抑制率均在質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值,分別為(46.34±1.20)%、(76.94±0.73)%。經(jīng)計(jì)算,兩者抑制α-淀粉酶的IC50分別為27.22、10.66 mg/mL,可知同條件下,孔石莼多糖鋅樣液對(duì)α-淀粉酶的抑制能力達(dá)到孔石莼多糖樣液的2.55 倍。

    3 結(jié) 論

    本研究以實(shí)驗(yàn)室自制的孔石莼多糖為試材,制備孔石莼多糖鋅絡(luò)合物,采用GS-MS、GPC-MALLS-RI、剛果紅實(shí)驗(yàn)、紫外-可見(jiàn)光譜、傅里葉變換紅外光譜、XRD、SEM、AFM等對(duì)孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,并通過(guò)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制實(shí)驗(yàn)比較兩者的體外降血糖活性,探究絡(luò)合鋅改性對(duì)孔石莼多糖結(jié)構(gòu)與重要生物活性的影響,主要結(jié)論如下:1)孔石莼多糖是由鼠李糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的雜多糖,其中各單糖基的物質(zhì)的量比為1.00∶0.06∶0.93∶0.45∶2.29∶0.07;經(jīng)過(guò)絡(luò)合鋅反應(yīng),產(chǎn)物中孔石莼多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有原來(lái)的53.35%下降至49.40%。2)GPC-MALLS-RI分析結(jié)果顯示,孔石莼多糖鋅的分子質(zhì)量、分子尺寸較原多糖明顯減小,但分子質(zhì)量分布范圍明顯變寬,兩者的構(gòu)象均為高支化度結(jié)構(gòu);剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)絡(luò)合鋅改性,產(chǎn)物中孔石莼多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)基本消失。3)結(jié)合紫外-可見(jiàn)光譜與紅外光譜檢測(cè)結(jié)果推測(cè),孔石莼多糖中的—COO-、—CH3、—OSO3-等基團(tuán)與Zn2+發(fā)生了反應(yīng);XRD檢測(cè)結(jié)果表明,孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物均為無(wú)定形結(jié)構(gòu),且Zn2+高度分散在后者的糖鏈上。4)SEM觀察結(jié)果提示,孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的表面形貌產(chǎn)生明顯差異,孔石莼多糖與Zn2+除了發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)外,還可能存在物理吸附現(xiàn)象;AFM結(jié)果顯示,孔石莼多糖鋅的分子形貌較原多糖的發(fā)生了明顯變化,其分子團(tuán)聚性顯著增強(qiáng),分子聚集體尺寸明顯增大,且整體分布差別變大。5)孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物在實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有一定的體外降血糖活性,且存在量效關(guān)系;相同質(zhì)量濃度下,孔石莼多糖鋅對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制率均顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)高于孔石莼多糖,前者的抑制能力分別是后者的1.81、2.55 倍。推測(cè)可能是經(jīng)過(guò)絡(luò)合反應(yīng),孔石莼多糖的活性基團(tuán)與Zn2+產(chǎn)生了協(xié)同作用,從而增強(qiáng)了其體外降血糖活性。此外,在絡(luò)合過(guò)程中多糖發(fā)生了部分降解,使得更多的活性基團(tuán)得到暴露,亦可能是孔石莼多糖鋅體外降血糖活性強(qiáng)于原多糖的原因之一。

    綜上,絡(luò)合鋅改性使孔石莼多糖鋅的分子結(jié)構(gòu)特征較原多糖發(fā)生明顯改變,體外降血糖活性顯著增強(qiáng),其作為一種新型的多糖補(bǔ)鋅劑,具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

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