熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值

匡林芝 周崢珍 張麗瓊 劉敏

結(jié)核病作為世界范圍內(nèi)的重大傳染性疾病，是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，近年來(lái)呈現(xiàn)出發(fā)病率升高的趨勢(shì)［1］。據(jù)估計(jì)全球約有1/3人口感染了結(jié)核分枝桿菌，每年約有150～200萬(wàn)患者因結(jié)核病死亡［2］。結(jié)核病會(huì)累及全身多個(gè)器官，其中累及肺部導(dǎo)致肺結(jié)核的情況最為常見(jiàn)［3］。結(jié)核病的防治重點(diǎn)是早發(fā)現(xiàn)、早隔離和及早治療活動(dòng)性的肺結(jié)核［4］。目前，肺結(jié)核的病原學(xué)檢查主要包括涂片和培養(yǎng)，但涂片檢測(cè)陽(yáng)性率低，而培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，加之臨床上肺結(jié)核的癥狀大多表現(xiàn)不典型，且影像學(xué)表現(xiàn)特征性不足，因而肺結(jié)核患兒中仍有部分較難獲得早期確診，甚至發(fā)生誤診和漏診［5］。與常規(guī)檢查方法相比，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)的特異度和敏感度更高，能夠檢測(cè)到1～100 fg的純化結(jié)核分枝桿菌脫氧核糖核酸（Mycobacterium tuberculosis DNA，TbDNA）［6］。支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）從遠(yuǎn)端氣道及肺泡腔取材，該部位細(xì)菌含量較高，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA，可以輔助傳統(tǒng)方法對(duì)肺結(jié)核進(jìn)行早期診斷［7］。本研究對(duì)本院收治的21例肺結(jié)核患兒及同期21例排除肺結(jié)核感染的肺部疾病患兒行痰涂片抗酸染色鏡檢、纖維支氣管鏡（纖支鏡）痰涂片抗酸染色鏡檢和BALF中TbDNA熒光定量PCR檢測(cè)，旨在評(píng)估熒光定量PCR檢測(cè)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 選擇2018年1月—2020年1月本院收治的21例肺結(jié)核患兒作為肺結(jié)核組，患兒均符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》公布的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］，其中男性15例，女性6例；年齡4個(gè)月～16歲，平均（7.67±3.59）歲。另選同時(shí)期接受相關(guān)檢查和治療且排除肺結(jié)核感染的21例肺部疾病患兒為非肺結(jié)核組，其中男性15例，女性6例；年齡4個(gè)月～16歲，平均（9.01±3.05）歲；細(xì)菌性肺炎12例，真菌性肺炎6例，支氣管擴(kuò)張癥2例，膿胸1例。兩組患兒的性別、年齡等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），有可比性。

1.2 檢測(cè)方法 全部患兒均行痰涂片鏡檢、纖支鏡痰涂片鏡檢和TbDNA熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.1 痰涂片抗酸染色鏡檢 全部患兒均于漱口后留取晨痰為痰標(biāo)本，行抗酸染色后鏡檢，鏡下觀察到結(jié)核分枝桿菌代表陽(yáng)性，未觀察到代表陰性。

1.2.2 纖支鏡痰涂片抗酸染色鏡檢 全部患兒行支氣管鏡依次觀察大氣道和左右各葉、段支氣管，同時(shí)吸取分泌物，涂片行抗酸染色。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè) 收集BALF，對(duì)常規(guī)氣管鏡下見(jiàn)異常或胸片及胸部CT提示相關(guān)病灶對(duì)應(yīng)的葉段支氣管進(jìn)行灌洗，并使用無(wú)菌灌洗液瓶收集約20 mL BALF，密封并立即送檢，取5 mL進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)TbDNA，如檢測(cè)值≥500拷貝/mL為陽(yáng)性，反之檢測(cè)值＜500拷貝/mL為陰性。熒光定量PCR檢測(cè)使用TbDNA試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），嚴(yán)格按照試劑盒規(guī)程操作。

1.3 分析方法 以a表示真陽(yáng)性例數(shù)，b表示假陽(yáng)性例數(shù)，c表示真陰性例數(shù)，d表示假陰性例數(shù)；按以下公式計(jì)算：敏感度＝a /（a+d）×100%；特異度＝c /（c+b）×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（positive predictive value，PPV）＝a /（a+b）×100%；陰性預(yù)測(cè)值（negative predictive value，NPV）＝c /（c+d）×100%。

1.4 倫理學(xué) 本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：HCHLL-2020-15），所有對(duì)患兒的檢測(cè)均獲得過(guò)患兒家屬的知情同意。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以例（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同檢測(cè)方法結(jié)果比較 熒光定量PCR的陽(yáng)性率明顯高于痰涂片抗酸染色鏡檢和纖支鏡痰涂片抗酸染色鏡檢（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患兒痰涂片抗酸染色鏡檢、纖支鏡痰涂片抗酸染色鏡檢與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 不同檢測(cè)方法診斷肺結(jié)核的敏感度、特異度和預(yù)測(cè)值比較 熒光定量PCR的敏感度明顯高于痰涂片抗酸染色鏡檢和纖支鏡痰涂片抗酸染色鏡檢（P＜0.05），3種方法的特異度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 2。

表2 不同方法診斷肺結(jié)核的敏感度、特異度及預(yù)測(cè)值比較

3 討論

目前，肺結(jié)核是臨床上常見(jiàn)的慢性傳染性疾病，找到一種可以在疾病早期快速、準(zhǔn)確診斷肺結(jié)核的方法是治療結(jié)核病的關(guān)鍵［9］。在肺結(jié)核的診斷中，檢測(cè)痰液、BALF和漿膜腔積液中的結(jié)核桿菌是最為有效的方法；這是由于結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁中脂類含量豐富，較難著色，而延長(zhǎng)染色時(shí)間并加溫處理后，使用酸性脫色劑就會(huì)較難被脫色。根據(jù)這一原理，在臨床上對(duì)于疑似肺結(jié)核的患兒通過(guò)痰涂片行抗酸染色鏡檢，操作簡(jiǎn)便、快速，是一種應(yīng)用廣泛的肺結(jié)核診斷方法［10］。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)痰涂片抗酸染色鏡檢診斷肺結(jié)核的敏感性僅有19.05%，而纖支鏡痰涂片抗酸染色鏡檢診斷肺結(jié)核的敏感性僅有14.29%，與吳淑紅等［10］的研究結(jié)果相似，這可能與痰標(biāo)本收集不當(dāng)、排菌量少等因素有關(guān)，因此，痰涂片及纖支鏡痰涂片抗酸染色鏡檢均無(wú)法滿足臨床早期診斷的要求。

在全國(guó)肺結(jié)核流行病學(xué)調(diào)查及實(shí)際臨床中，肺結(jié)核患者中痰涂片鏡檢結(jié)果為陰性者占全部結(jié)核病患者的50%～70%［11］。隨著分子生物學(xué)的日益發(fā)展，熒光定量PCR開始在肺結(jié)核診斷中應(yīng)用。熒光定量PCR優(yōu)勢(shì)顯著，其敏感度和準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便，安全快速且定量范圍廣，可以廣泛應(yīng)用于外周血、痰標(biāo)本及BALF檢測(cè)，尤其是針對(duì)含菌量低的待測(cè)標(biāo)本。BALF直接從遠(yuǎn)端氣道及肺泡腔取材，其接觸病灶的范圍較廣，細(xì)菌的含量較高，污染概率較低，而灌洗會(huì)刺激患兒發(fā)生咳嗽，促進(jìn)局部支氣管中的分泌物引流。本研究顯示，熒光定量PCR檢測(cè)BALF中TbDNA的敏感度、特異度、PPV、NPV分別為76.19%、95.24%、94.12%、80.00%，其敏感度明顯高于痰涂片鏡檢、纖支鏡痰涂片鏡檢方法。熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA通?？稍? d內(nèi)得到結(jié)果，具有敏感、快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，值得在臨床上推廣。出現(xiàn)假陰性的原因可能有：① 個(gè)體免疫差異較大，取材標(biāo)本內(nèi)Taq酶抑制因子含量較高而影響PCR擴(kuò)增進(jìn)程；② 部分患兒感染的結(jié)核分枝桿菌中缺失IS6110序列；③ 患兒病程較短；④ 用藥影響等。本研究非肺結(jié)核組中有1例患兒發(fā)生假陽(yáng)性，可能是因?yàn)闃?biāo)本間污染，患兒存在其他病灶，而此法無(wú)法區(qū)分死菌和活菌，擴(kuò)增了潛伏感染的結(jié)核分枝桿菌［12-15］。因此對(duì)病情的判斷仍應(yīng)結(jié)合其他檢查結(jié)果綜合判斷。

綜上所述，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)BALF中的TbDNA，具有快速、敏感度高、特異度高的特點(diǎn)，利于早期診斷肺結(jié)核，尤其對(duì)于痰涂片檢測(cè)呈陰性及無(wú)典型影像學(xué)特征的患兒，可以明顯提高確診率，其結(jié)果能夠作為診斷肺結(jié)核的主要依據(jù)指標(biāo)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突