磁性固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定環(huán)境水樣中12種喹諾酮類抗生素殘留

魏 丹，國 明，吳慧珍，陶星名

(1．杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院 健康與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)系,杭州310023; 2．浙江省化工研究院 分析測試中心,杭州310023;3．浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院,杭州310023)

喹喏酮類抗生素是在母核4-喹酮相應(yīng)位置引入不同基團(tuán)進(jìn)行人工合成的一種抗生素。喹喏酮類藥物具有廣譜、耐藥性低、不良反應(yīng)少、使用方便、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于臨床、畜牧和水產(chǎn)等領(lǐng)域,但是由于長期對(duì)喹諾酮抗生素的不合理使用和排放,造成了該類抗生素對(duì)土壤及其周圍地表水的污染。這種抗生素不僅會(huì)抑制環(huán)境中有益微生物的活性,刺激病原菌產(chǎn)生抗藥性,對(duì)陸生或水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng),還會(huì)通過飲用水、食物鏈等方式進(jìn)入人體進(jìn)而影響人體健康。由于水體中該類抗生素的種類繁多且含量較低(多以ng·L－1級(jí)的低質(zhì)量濃度存在[1])。因此,建立該類抗生素殘留的快速靈敏的檢測方法十分重要。

目前,喹諾酮類抗生素殘留的測定方法主要有微生物法、免疫檢測法[2]、高效液相色譜法[3-5]、液相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]和高效毛細(xì)管電泳法等。其中,液相色譜-質(zhì)譜法具有靈敏高效、快速準(zhǔn)確和專屬性強(qiáng)等優(yōu)勢,在喹諾酮類藥物殘留分析領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[7]。磁固相萃取(MSPE)是一種以磁性材料為吸附劑的固相萃取(SPE)技術(shù),與傳統(tǒng)的固相萃取方法相比,該方法更簡便、快速、經(jīng)濟(jì),其在分析檢測的領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

本工作用零價(jià)納米鐵(nZVI)和氧化石墨烯(GO)制備了GO＠n ZVI磁性材料,這種復(fù)合材料中具有大π共軛體系、比表面積較大、在水溶液中的分散性良好等特點(diǎn),可以和喹諾酮藥物分子形成π-π共軛結(jié)構(gòu),對(duì)喹諾酮類抗生素具有較大的吸附容量和良好的回收率。本工作先用磁性材料對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行固相萃取,然后再進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定,以期為該類抗生素的檢測提供技術(shù)支持和參考。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1290 infinity型高效液相色譜儀;6460 Triple Quad 型質(zhì)譜儀;Milli-Q 型超純水器;KQ-100DE型超聲波清洗器;Seven Easy S30型p H 計(jì)。

GO 儲(chǔ)備溶液:在1．0 g GO 中加1 L的水,超聲分散15 min,加水配制成1 000 mg·L－1的 GO 儲(chǔ)備溶液,常溫保存。

12種喹諾酮抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別稱取0．100 0 g的沙拉沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星、諾氟沙星、洛美沙星、吡呱酸、西諾沙星、噁喹酸、萘啶酸于100 m L容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得到1 000 mg·L－1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。使用時(shí),以含有0．2%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的20%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液稀釋至所需濃度。

依諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、噁喹酸、吡呱酸、萘啶酸和西諾沙星等喹諾酮抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99．0%;甲醇、乙腈均為色譜純;二氯甲烷,乙酸,氨水,乙酸銨等為分析;nZVI 的純度大于99．5%;GO 的純度大于99%;試驗(yàn)用水為超純水(電阻率不小于18．2 MΩ·cm)。

1．2 儀器工作條件

1)色譜條件 ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(3．0 mm×100 mm,1．8μm),柱溫35 ℃;流量0．3 m L·min－1;進(jìn)樣量10μL;流動(dòng)相為甲醇(A)和1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液(B);梯度洗脫程序:0～1 min時(shí),A 為10%;1～7 min時(shí),A 由10%升至40%;7～10 min 時(shí),A 由40%升至60%;10～11 min時(shí),A 由60%升至90%;11～12 min時(shí),A由90%降至10%,保持3 min。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),采用正離子檢測模式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;干燥氣氮?dú)?溫度為300 ℃,流量5 L·min－1;霧化氣氮?dú)?壓力310 k Pa;鞘氣為氮?dú)?溫度250 ℃,流量10 L·min－1;毛細(xì)管電壓3 500 V。

12種喹諾酮的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab．1 MS parameters

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 GO＠nZVI磁性材料的制備

常溫下,將1．0 g的nZVI加入至10 m L 水中,超聲分散15 min。然后再加入50 m L 的GO 儲(chǔ)備溶液,渦旋振蕩30 s,用磁鐵分離下層黑色沉淀物,即得到GO＠nZVI磁性材料。

1．3．2 測定方法

采集的環(huán)境水樣經(jīng)0．22μm 微孔濾膜過濾除去懸浮顆粒物。稱取15 mg的GO＠nZVI磁性材料于10．0 m L燒杯中,依次用甲醇、水清洗和活化后,加入10 m L 水樣,用乙酸和氨水調(diào)節(jié)酸度至p H 7．0,振蕩5 min,使GO＠nZVI磁性材料對(duì)喹諾酮抗生素進(jìn)行充分吸附;用磁鐵將GO＠nZVI材料分離收集在燒杯底部,棄去上清液。在磁性材料中加入1．0 m L 氨水,超聲10 min 進(jìn)行洗脫,重復(fù)2次,合并洗脫液并吹氮至近干,用100μL 水溶解殘留物,過0．22μm 微孔濾膜,濾液按照儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2．1 GO＠nZVI磁性材料表征

對(duì)GO＠nZVI磁性材料進(jìn)行了SEM 和FTIR表征,見圖1。

圖1 GO/nZVI的SEM 圖和FTIR 圖Fig．1 SEM image and FTIR spectrum of GO/nZVI

由圖1(a)可以看出:nZVI被GO 片層結(jié)構(gòu)附著,其表面相連團(tuán)聚在一起,形成蓬松的結(jié)構(gòu),直徑為100～500 nm,這是由于nZVI與GO 混合后,在靜電相互作用力的驅(qū)動(dòng)下,兩者迅速沉降所致。從圖1(b)可以看出:GO 的特征峰如－COOH(1 725 cm－1)、C－O－C(1 224 cm－1)和C－OH(1 042 cm－1)的特征峰完全消失,GO/nZVI磁性材料的紅外吸收譜線和nZVI的完全重疊,說明GO已緊密附著于nZVI的表面。

2．2 磁性固相萃取條件的優(yōu)化

吸附和洗脫過程是影響磁性固相萃取效果的關(guān)鍵步驟,試驗(yàn)考察了吸附劑用量(5,10,15,18,20 mg)、吸附時(shí)間(1,2,3,5,8,10 min)、洗脫劑種類(甲醇、水、p H 9氨水溶液、p H 11氨水溶液和氨水)和洗脫時(shí)間(5,10,15 min)對(duì)10 m L 的10．0μg·L－1喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的萃取回收率的影響,見圖2。

由圖2(a)可知:12種喹諾酮的萃取回收率隨吸附劑用量的增加而增加,當(dāng)吸附劑用量大于15 mg時(shí),萃取回收率基本保持穩(wěn)定?？紤]到吸附劑用量越多越不利于洗脫,試驗(yàn)選取吸附劑的用量為15 mg。如圖2(b)所示:當(dāng)吸附時(shí)間為5 min 時(shí),12種喹諾酮的萃取回收率較大,繼續(xù)增加吸附時(shí)間,萃取回收率基本保持不變,試驗(yàn)選擇的吸附時(shí)間為5 min。由圖2(c)可知:和甲醇、水、p H 9的氨水溶液、p H 11的氨水溶液相比,氨水對(duì)目標(biāo)物的萃取回收率較高,試驗(yàn)選擇氨水作洗脫劑。由圖2(d)可知:萃取回收率隨洗脫時(shí)間的延長而增加,當(dāng)洗脫時(shí)間大于10 min時(shí),萃取回收率基本不變。試驗(yàn)選擇的洗脫時(shí)間為10 min。

2．3 磁性材料的可重復(fù)利用性

可重復(fù)利用性是評(píng)價(jià)磁性材料的重要指標(biāo)之一。按照測定方法用磁性材料對(duì)喹諾酮抗生素進(jìn)行磁固相萃取,重復(fù)使用10次后,磁性材料對(duì)目標(biāo)物的萃取回收率較第一次的減少約10%,說明GO＠nZVI磁性材料具有良好的可重復(fù)利用性。

2．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件對(duì)12種喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,以各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,各喹諾酮抗生素的線性范圍均為1～50μg·L－1,線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表2。

以3倍信噪比計(jì)算檢出限(3S/N),10 倍信噪比計(jì)算測定下限(10S/N),結(jié)果見表2。

2．5 精密度試驗(yàn)

按照測定方法對(duì)含有5．0,10,20μg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白樣品進(jìn)行測定,以5次重復(fù)測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)計(jì)算日內(nèi)精密度,連續(xù)5 d測定結(jié)果的RSD 計(jì)算日間精密度,結(jié)果見表3。

添加了20μg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白水樣的色譜圖見圖3。

圖2 12種喹諾酮抗生素在不同條件下的固相萃取回收率的影響Fig．2 Solid phase extraction recovery of the 12 quinolone antibiotics obtained under various conditions

表2 線性參數(shù)、檢出限、測定下限和精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab．2 Linearity parameters，detection limits，lower limits of determination and results of tests for precision

2．6 回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)杭州地區(qū)3種空白環(huán)境水樣(西溪濕地水、自來水和茶園灌溉用水)中的喹諾酮類抗生素的含量進(jìn)行測定,均未檢出喹諾酮類抗生素殘留。以這3種環(huán)境水樣為基底進(jìn)行3 個(gè)濃度水平(5．0,10,20μg·L－1)的加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見表4。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab．3 Results of tests for precision

圖3 空白水樣中混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig．3 Chromatogram of mixed standard solution added in blank water sample

表4 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab．4 Results of test for recovery

本工作建立了磁性固相萃取-HPLC-MS/MS測定環(huán)境水樣中12種微量喹諾酮類藥物殘留的方法,與其他文獻(xiàn)報(bào)道的方法相比[8-11],該方法具有綠色環(huán)保、檢出限低、重現(xiàn)性好等特點(diǎn),適用于環(huán)境水樣中微量喹諾酮類藥物的富集及檢測。