納米銀表面增強(qiáng)拉曼光譜法測(cè)定保健食品中非法添加的4種地平類降壓藥物

周亞紅，吳國(guó)萍，黃嘉婕

(1．江蘇警官學(xué)院 刑事科學(xué)技術(shù)系,南京210031; 2．江蘇省食品藥品與環(huán)境犯罪檢驗(yàn)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室,南京210031)

近年來,生活條件的不斷改善,促使了人們的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,高油高脂食品攝入量明顯增多,加上精神、環(huán)境和其他疾病的影響,高血壓已成為最常見的人類健康殺手。鹽酸貝尼地平、鹽酸尼卡地平、硝苯地平、阿雷地平是醫(yī)學(xué)上常見的地平類降壓藥。近年來在各種利益的驅(qū)動(dòng)下,不法商家在保健品中非法添加上述降壓藥的情況愈演愈烈,由于這些保健品中沒有標(biāo)明降壓藥的劑量,可能會(huì)使不知情的患者服用后產(chǎn)生不良反映,甚至產(chǎn)生肝損傷等毒副作用。2016年,中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局開展了針對(duì)保健食品等3類食品中非法添加問題的專項(xiàng)治理工作,其中就包括對(duì)涉嫌非法添加降壓藥的保健食品的抽樣檢驗(yàn)。

地平類降壓藥的測(cè)定方法有薄層色譜法(TLC)[1]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[2]、高效液相色譜法(HPLC)[2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[3]、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)、近紅外-局部直線篩選法(NIR-LSLS)、聯(lián)用技術(shù)和基因芯片技術(shù)[4]、激光拉曼光譜分析法[5-10]等,但這些方法通常用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

本工作基于表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù),以銀納米粒子作為表面增強(qiáng)劑,對(duì)鹽酸貝尼地平、鹽酸尼卡地平、硝苯地平、阿雷地平等4種地平類降壓藥進(jìn)行了快速檢測(cè),可為食品藥品與環(huán)境犯罪現(xiàn)場(chǎng)的批量樣品的快速檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Fresco 21型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī);85-2型磁力攪拌器;JEM-2100(HR)型高分辨透射電子顯微鏡(TEM);SSR-3010 型簡(jiǎn)智儀器便攜式拉曼光譜分析儀;WIGGENS Vortex 3000型渦旋振蕩器混合器;HG 202A-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱;Milli-Q Intergral 5型純水機(jī);JL型超聲波清洗器。

4種地平類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:10 mg·L－1,稱取4種地平類標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,加入水溶解并轉(zhuǎn)移至1 L的容量瓶中,然后用水稀釋至刻度。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:分別加入10,20,30,40,50,60,70,80,90 m L的鹽酸貝尼地平、鹽酸尼卡地平、硝苯地平、阿雷地平標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至100 m L 的容量瓶中,用水稀釋至刻度,得到1．0,2．0,3．0,4．0,5．0,6．0,7．0,8．0,9．0,10．0 mg·L－1標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

鹽酸貝尼地平、鹽酸尼卡地平、硝苯地平、阿雷地平標(biāo)準(zhǔn)品的純度均為99．9%;檸檬酸三鈉、硝酸銀、硝酸、甲醇、氫氧化鈉為分析純;鹽酸為優(yōu)級(jí)純;試驗(yàn)用水為二次去離子水。

1．2 儀器工作條件

激光發(fā)射功率1 500 m W,分辨率6 cm－1,積分時(shí)間10 s,平均積分2次,平滑度為1,光譜掃描范圍為200～4 000 cm－1。

1．3 試驗(yàn)方法

由于SERS方法需要采用納米銀作為表面增強(qiáng)劑,而納米銀的制備方法有很多[11-15],本工作采用了檸檬酸三鈉加熱還原的方法制備納米銀。取400 m L的燒杯,加入194 m L 水,在磁力加熱攪拌器上加熱至沸后,攪拌速度控制在470 r·min－1,邊攪拌邊加入1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的硝酸銀溶液3．4 m L和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的檸檬酸三鈉溶液4 m L,于100 ℃繼續(xù)加熱1 h。溶液顏色變化過程為無(wú)色透明-淺黃色透明-桔黃色-灰綠色。關(guān)閉加熱源,繼續(xù)攪拌冷卻至室溫后,倒入2 m L 離心管中,以2 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心8 min,取上層清液,以6 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心15 min,取下層沉淀,用水溶解并定容至1．0 m L,搖勻后,在2 ℃冷藏條件下避光保存。

稱取0．103 0 g碾碎的疑似非法添加的保健食品,將其置于15 m L炮彈管中,加入10 m L甲醇,超聲5 min后,以3 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min,離心后取1 m L上清液,用甲醇定容至10．0 m L,得到地平類降壓藥品待測(cè)液。取100μL 的地平類降壓藥品待測(cè)液,加入200μL 制備好的納米銀(表面增強(qiáng)劑),2∶7(體積比)的鹽酸溶液20μL(助劑),以400 r·min－1的轉(zhuǎn)速振蕩10 s,然后在儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 納米銀的表征

為了確保合成的納米銀的粒徑為50～80μm,形貌基本球形,對(duì)其進(jìn)行了TEM 表征。把制備的納米銀樣品分別滴在預(yù)先覆蓋Formvar膜的銅網(wǎng)上,自然干燥后采用TEM 在75 k V 的加速電壓下對(duì)樣品的形貌和顆粒大小進(jìn)行觀察,見圖1。

圖1 納米銀的TEM 圖Fig．1 TEM image of nanometer silver

由圖1可知:制備所得的納米銀主要為球狀納米銀,其粒徑為50～80 nm。TEM 圖中還觀察到了少量棒狀納米銀,這會(huì)影響拉曼光譜的增強(qiáng)效果。為了避免大量棒狀納米銀的出現(xiàn),需要在制備納米銀時(shí)固定適當(dāng)?shù)募訜釙r(shí)間和攪拌速度。

2．2 助劑的選擇

納米銀合成過程中,助劑可以通過影響納米銀的聚合情況來改變納米銀顆粒的大小,進(jìn)而影響納米銀的表面增強(qiáng)效果。以9．0 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為研究對(duì)象,試驗(yàn)考察了1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉溶液、1∶5(體積比)硝酸溶液、2∶7(體積比)鹽酸溶液等3種助劑對(duì)貝尼地平、鹽酸尼卡地平、硝苯地平、阿雷地平的測(cè)定值的影響,結(jié)果見圖2。

由圖2可知:使用2∶7 的鹽酸溶液作為助劑時(shí),4種樣品的拉曼特征峰均較為清晰,特征峰強(qiáng)度較高,使用1%的氫氧化鈉溶液作為助劑時(shí),4種樣品的特征峰出峰狀況不好,大部分峰得不到增強(qiáng),圖譜顯示不清晰,使用1∶5的硝酸溶液作為助劑時(shí),硝苯地平和阿雷地平樣品的出峰情況不好且大部分峰得不到增強(qiáng),圖譜顯示不清晰,此時(shí)的鹽酸貝尼地平和鹽酸尼卡地平圖譜拉曼特征峰較為清晰,但強(qiáng)度不高。因此以2∶7的鹽酸作為助劑用于鹽酸貝尼地平、鹽酸尼卡地平、硝苯地平、阿雷地平等4種物質(zhì)的測(cè)試效果更好。

圖2 不同助劑測(cè)得的4種地平類藥物SERS譜圖Fig．2 SERS spectra of four diping drugs detected with different additives

2．3 4種地平類藥物的SERS譜圖

按照儀器工作條件對(duì)質(zhì)量濃度為9．0 mg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)試,測(cè)得的結(jié)果見表1 和圖3。

表1 4種地平類藥品表面增強(qiáng)拉曼光譜特征頻率Tab．1 Characteristic frequencies of surface enhanced Raman spectra of four dipine drugs

由表1和圖3可以看出:4種地平類降壓藥的表面增強(qiáng)拉曼頻率有相似的波數(shù),分別位于634～645 cm－1,993～1 000 cm－1,1 028～1 043 cm－1,1 154～1 211 cm－1,1 344～1 346 cm－1,1 599～1 641 cm－1處。這是因?yàn)辂}酸貝尼地平、鹽酸尼卡地平、硝苯地平、阿雷地平等4種物質(zhì)均屬于二氫吡啶類鈣拮抗劑,均含有如圖4所示的苯基-1,4-二氫吡啶的骨架(R1、R2、R3、R4、R5分別對(duì)應(yīng)不同的取代基,見表2),通過這6個(gè)特征峰可以初步判斷這些藥物為地平類藥物。

由表2可知:鹽酸貝尼地平與鹽酸尼卡地平的取代基類似,僅R2為不同的胺基,前者比后者多了1 429．8 cm－1處的特征峰;硝苯地平與阿雷地平的取代基類似,但前者R3為脂基,多了789,1 183,1 414,1 482,1 685 cm－1等處的特征峰,后者的R3為甲基,在920 cm－1處有明顯的特征峰;因此可根據(jù)表2中所列出的特征峰對(duì)這4種地平類藥物進(jìn)行定性識(shí)別。由于4種地平類藥物的取代基種類或位置不同,造成了苯基-1,4-二氫吡啶骨架特征峰的位置產(chǎn)生不同的偏移。

圖3 4種地平類藥品的SERS光譜圖Fig．3 SERS spectra of four dipine drugs

圖4 苯基-1,4-二氫吡啶的分子結(jié)構(gòu)式Fig．4 Molecular structure of phenyl-1,4-dihydropyridine

2．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

根據(jù)儀器工作條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定。由于SERS做定量分析時(shí)容易受各種因素的影響,直接以特征峰強(qiáng)度的絕對(duì)值進(jìn)行定量不能得到準(zhǔn)確結(jié)果。因此,在實(shí)際SERS分析中,常選擇以某一官能團(tuán)對(duì)應(yīng)的特征峰值為測(cè)定值,以不隨含量變化的峰值作為內(nèi)標(biāo)值,以測(cè)定值和內(nèi)標(biāo)值之比進(jìn)行定量分析,其中,鹽酸貝尼地平選擇了1 000．9 cm－1和1 641．9 cm－1處的特征峰強(qiáng)度比值,鹽酸尼卡地平選擇了998．4 cm－1和460．9 cm－1處的特征峰強(qiáng)度比值,硝苯地平選擇了634．7 cm－1和993．4 cm－1處的特征峰強(qiáng)度比值,阿雷地平選擇了1 154．7 cm－1和390．2 cm－1處的特征峰強(qiáng)度比值。以4種地平類藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的特征峰強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表3。

表2 苯基-1，4-二氫吡啶分子結(jié)構(gòu)式中的不同取代基Tab．2 Different substituents in themolecular structure of phenyl-1，4-dihydropyridine

按照最低特征峰高為噪聲的3 倍計(jì)算檢出限(3S/N),結(jié)果見表3。

表3 線性參數(shù)和檢出限Tab．3 Linearity parameters and detection limits

由表3 可知:4 種地平類藥物的檢出限為0．40～0．75 mg·L－1,能適用于地平類藥物快速檢測(cè)的要求。

2．5 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)

在水中分別加入不同濃度水平的4種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收試驗(yàn),每種目標(biāo)物配制成5份,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算其回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),見表4。

表4 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab．4 Result of tests for precision and recovery

由表4 可知:4 種地平類藥物的回收率為96．0%～108%,RSD 為1．0%～5．9%,說明所建立的方法精密度、準(zhǔn)確度質(zhì)量好,在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中有較好的推廣使用價(jià)值。

2．6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)繳獲的疑似非法添加的保健食品進(jìn)行測(cè)定,得到的譜圖見圖5。

圖5 樣品的SERS光譜圖Fig．5 SERS spectrum of the sample

由圖5可知:保健食品測(cè)得的譜圖與鹽酸尼卡地平的譜圖大致吻合,說明該保健食品非法添加了鹽酸尼卡地平,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10．4%。

本試驗(yàn)使用檸檬酸三鈉還原法制備了納米銀,以2∶7(體積比)鹽酸溶液作為助劑,采用便攜式拉曼光譜儀對(duì)保健食品中非法添加的鹽酸貝尼地平、鹽酸尼卡地平、硝苯地平、阿雷地平進(jìn)行了測(cè)定,該方法靈敏度高,簡(jiǎn)單,且具有一定的準(zhǔn)確性,適合于食品藥品與環(huán)境犯罪案件中現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。