AR-V7的檢測(cè)技術(shù)及其在去勢(shì)抵抗性前列腺癌診斷中的研究進(jìn)展

尹冶，段秋婷，周晉宇，陳振杰，輝紅蕾綜述；王玉明審校

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.泌尿外科，云南 昆明 650000）

截止2019年,美國(guó)確診的PCa病例數(shù)超過(guò)174,650例，約31,620人死于該病[1]。我國(guó)男性PCa發(fā)病率與死亡率均呈快速上升的趨勢(shì),據(jù)國(guó)家癌癥登記中心統(tǒng)計(jì)，截止2015年，該病患病人數(shù)超過(guò)6萬(wàn)，死亡率達(dá)1/3，而這些數(shù)據(jù)僅僅覆蓋了全國(guó)人口的6.5%[2]，情況不容樂(lè)觀。該病早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時(shí)常已是晚期,雄激素剝奪療法(Androgen deprivation therapy,ADT)是晚期PCa的主要治療方案，然而，絕大多數(shù)患者在經(jīng)過(guò)一定的緩解期后開始抵抗內(nèi)分泌治療,最終發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC),并常伴器官轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，死亡率高[3]。前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）是臨床公認(rèn)的PCa標(biāo)記物，有較高的組織特異性，但PSA的水平受前列腺癌分化程度和轉(zhuǎn)移情況的影響，且在良性和惡性前列腺疾病中均升高，一定數(shù)值范圍內(nèi)不具腫瘤特異性[4]。研究表明[5-8]，雄激素受體（androgen receptor，AR）信號(hào)通路再激活是CRPC發(fā)生、發(fā)展和耐藥的重要作用機(jī)制，AR-V7在CRPC患者中高表達(dá)并與PSA濃度正相關(guān)，是激活這一通路的關(guān)鍵所在，也是CRPC最具潛力的標(biāo)記物。但目前AR-V7的檢測(cè)技術(shù)要求嚴(yán)格且難以推廣,臨床研究中一直缺乏大量的前瞻性數(shù)據(jù)對(duì)ARV7作為CRPC的新標(biāo)記物進(jìn)行可靠的驗(yàn)證?？上驳氖?，近年來(lái)AR-V7的檢測(cè)手段取得了一系列的新突破，為推進(jìn)AR-V7在臨床常規(guī)中的應(yīng)用提供重要的技術(shù)支持。

1 AR-V7的結(jié)構(gòu)

AR是核受體超家族中的一種類固醇類反轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白,其基因位于Xq11-12，有八個(gè)外顯子和七個(gè)內(nèi)含子，可編碼919個(gè)氨基酸。全長(zhǎng)型雄激素受體（full-length androgen receptor,AR-FL）包括氨基末端域 (N-terminal domain,NTD)、DNA結(jié)合域（DNA-binding domain,DBD）、鉸鏈區(qū)和羧基末端配體結(jié)合域 (ligand-binding domain,LBD)見圖1。AR基因剪切重組后mRNA的翻譯停止在第16位氨基酸，形成缺乏LBD域的截短型AR受體，稱為雄激素受體剪切變異體（androgen receptor splice variants,AR-Vs），AR-V7 在 20 多種 AR-Vs中含量最多最具代表性,可檢測(cè)其同源編碼蛋白[9]。ARV7具有完整的NTD域、DBD域以及一個(gè)特殊的C端。NTD結(jié)合轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子后形成AF-1，并通過(guò)配體非依賴途徑活化,在無(wú)雄激素結(jié)合時(shí)仍然激活靶基因的轉(zhuǎn)錄；DBD內(nèi)含兩個(gè)α螺旋型鋅指結(jié)構(gòu)，參與特異堿基序列的識(shí)別，并促進(jìn)雄激素反應(yīng)元件同AR的結(jié)合；C端延伸結(jié)構(gòu)域的作用目前研究較少。

圖1 全長(zhǎng)雄激素受體（AR-FL）和剪切變異體7（AR-V7）轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)

2 AR-V7檢測(cè)方法的新進(jìn)展

對(duì)于CRPC中AR-V7的檢測(cè)，富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）提取 RNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）是目前最常用的方法。迄今為止，美國(guó)臨床上有兩種常用的基于CTC的檢測(cè)試劑[10]：Qiagen公司2018年在美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)年會(huì)上推出的Adna Test Prostate Cancer Panel AR-V7 Kit試劑盒,用PCR檢測(cè)被捕獲的CTC中AR-V7的水平；另一種是最近推出的將免疫熒光應(yīng)用于CTC中AR-V7蛋白質(zhì)的分析。常規(guī)活檢組織的檢測(cè)則以RNA原位雜交（RISH）、熒光原位雜交（FISH）、免疫組織化學(xué)染色（IHC）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）和蛋白印跡等為主。近年來(lái)，全血和尿液標(biāo)本中的AR-V7檢測(cè)引起了研究人員的注意，大量研究開始著力于完善和優(yōu)化常規(guī)檢測(cè)手段并開發(fā)無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便和高效的技術(shù)。

2.1 活檢組織中AR-V7的檢測(cè) 目前,前列腺穿刺活檢仍然是診斷PCa的金標(biāo)準(zhǔn),新鮮活檢組織常直接冷凍或用福爾馬林固定后制成石蠟包埋切片（FFPE）。常規(guī)AR-V7原位檢測(cè)以AR基因內(nèi)含子3內(nèi)的隱蔽外顯3b（CE3b）為靶位，使用集成的探針設(shè)計(jì)和信號(hào)放大策略將目標(biāo)信號(hào)放大數(shù)千倍，雖然與傳統(tǒng)的原位檢測(cè)相比，信噪比得以降低，但需要多個(gè)平鋪探針覆蓋1kb以上的靶序列，且AR-FL同樣具有CE3b序列，故AR-V7特異性剪切點(diǎn)的檢測(cè)分辨率較低。對(duì)此，Yezi等[11]設(shè)計(jì)并優(yōu)化了一種稱為BaseScope的探針，開發(fā)出高度特異和可量化的新型RISH方法，該探針?lè)謩e跨越AR外顯子 3（E3）和 CE3b、外顯子 7（E7）和外顯子 8（E8），連接形成“雙 Z”型的寡核苷酸序列（1-ZZ）并靶向覆蓋單個(gè)剪切點(diǎn),不同跨越點(diǎn)的剪切點(diǎn)可分別對(duì)AR-V7和AR-FL特異。應(yīng)用這種新方法定量檢測(cè)44名轉(zhuǎn)移性CRPC患者活檢組織中的AR-V7，若以0.4為RISH結(jié)果的cut-off值，則15名患者AR-V7陽(yáng)性，且經(jīng)LNCaP95細(xì)胞驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)BaseScope探針的特異性優(yōu)于常規(guī)探針。

原位檢測(cè)與蛋白印跡、RNA-Seq等方法聯(lián)合可提高AR-V7檢測(cè)的特異性和靈敏度[12,13]。Djusberg等[14]通過(guò)分析FISH的PCR拷貝數(shù)來(lái)評(píng)估AR基因的擴(kuò)增，用微陣列檢測(cè)CRPC患者AR基因擴(kuò)增時(shí)AR-V7mRNA的表達(dá)水平,并對(duì)高表達(dá)的標(biāo)本進(jìn)行IHC,最后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行蛋白定位的驗(yàn)證，結(jié)果顯示核定位染色增加,證實(shí)了AR-V7存在于細(xì)胞核中。LiHeng等[15]用兔單克隆抗體對(duì)168例CRPC活檢組織進(jìn)行IHC,根據(jù)免疫反應(yīng)評(píng)分（A R-V7陽(yáng)性：>2）分析AR-V7的表達(dá)情況。該研究考慮到PCa的異質(zhì)性，選擇AR-V7表達(dá)最強(qiáng)的區(qū)域進(jìn)行評(píng)估,并用靶向E1、E7和CE3b的siRNA轉(zhuǎn)染LNCaP和22Rv1細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以確保單克隆抗體與AR-V7的特異性結(jié)合。32例AR-V7陽(yáng)性切片顯示，AR-V7主要分散表達(dá)于惡性PCa的腔上皮細(xì)胞核中,且該類細(xì)胞占惡性腺體的15%-80%。另外，血管和基質(zhì)細(xì)胞AR-V7為陰性，可考慮作為IHC的內(nèi)部對(duì)照。兔單克隆抗體雖被普遍使用，但抗體常結(jié)合組織中的其他蛋白質(zhì)，降低檢測(cè)的特異性。因此，Sharp等[16]針對(duì)CE3b開發(fā)出重組兔單克隆抗體（RM7）,用western印跡驗(yàn)證抗體分子量，并通過(guò)免疫沉淀證實(shí)RM7與原有的ARV7抗體EPR15656相比，特異性和親和力均增加，脫靶率降低。以RM7為優(yōu)化抗體進(jìn)行CRPC組織的IHC檢測(cè)，133份FFPE標(biāo)本中有34份AR-V7核染色陽(yáng)性（核H評(píng)分＞10），其中41份轉(zhuǎn)移性腫瘤標(biāo)本的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄分析表明407個(gè)基因與AR-V7高表達(dá)相關(guān)。

組織活檢標(biāo)本中AR-V7的檢測(cè)經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀、靈敏度較高，但檢測(cè)周期冗長(zhǎng)、抗體特異性不足、難以長(zhǎng)期保存。不可否認(rèn)的是，即使量化標(biāo)準(zhǔn)不同，原位檢測(cè)仍是活檢組織檢查的關(guān)鍵技術(shù)，開發(fā)更高效可行的檢測(cè)手段將推進(jìn)AR-V7在臨床中的實(shí)際應(yīng)用。

2.2 CTC中AR-V7的檢測(cè) 相比侵入性組織活檢,液體活檢近幾年有巨大的發(fā)展趨勢(shì)。FDA將CTC定義為有核（DAPI+）、白細(xì)胞抗原陰性（CD45-）的上皮細(xì)胞（CK+），并批準(zhǔn)CTC計(jì)數(shù)作為PCa的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)[17]。但人體外周血中CTC僅占白細(xì)胞的百萬(wàn)分之一，細(xì)胞富集是檢測(cè)的關(guān)鍵。識(shí)別上皮源性標(biāo)志物（如上皮細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞角蛋白）的免疫細(xì)胞磁性富集法，借助鐵磁流體、磁性微粒或納米粒子等膠體分散體，加以磁場(chǎng)進(jìn)行強(qiáng)磁化，鐵磁流體中的磁性顆粒涂覆有針對(duì)上皮源性標(biāo)志物的抗體。一旦系統(tǒng)捕獲靶細(xì)胞，便用對(duì)上皮細(xì)胞特異的熒光抗體進(jìn)行標(biāo)記,從而對(duì)CTC進(jìn)行計(jì)數(shù)等系列分析[18]。也有其他平臺(tái)根據(jù)形態(tài)差異和電生理特征來(lái)捕獲CTC。但在完成上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中CTC的上皮細(xì)胞粘附分子減少或形態(tài)特征發(fā)生變化時(shí)，識(shí)別便無(wú)法進(jìn)行。且以CTC計(jì)數(shù)≥5的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估PCa患者的生存預(yù)后可信度低,臨床獲益小，而CTC中AR-V7的檢測(cè)可提供計(jì)數(shù)外的諸多信息,關(guān)鍵在于如何在數(shù)十億個(gè)血細(xì)胞中有效富集CTC以裂解進(jìn)行qRT-PCR，且目前有關(guān)AR-V7轉(zhuǎn)錄物比例的定量信息較少。

半自動(dòng)化CellSearch?系統(tǒng)是經(jīng)過(guò)全面的臨床試驗(yàn)后唯一獲得FDA批準(zhǔn)用于CTC計(jì)數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，該系統(tǒng)的出現(xiàn)使CTC中AR-V7的相關(guān)研究得以深入開展[19,20]。Sharp等[21]用AdnaTest試劑盒測(cè)定181名CRPC患者CTC(由CellSearch計(jì)數(shù))中的AR-V7，35%患者CTC+/AR-V7+,但尚無(wú)證據(jù)表明CTC中AR-V7陰性患者的生存率比陽(yáng)性患者低,且無(wú)CTC計(jì)數(shù)的患者取癌組織經(jīng)IHC亦可檢測(cè)到AR-V7,這提示了有關(guān)CTC中AR-V7狀態(tài)的預(yù)后研究必須考慮CTC計(jì)數(shù)以增加敏感度。應(yīng)該提及的是,研究證明[22]qRT-PCR中SYBRGreenⅠ法和TaqMan探針?lè)▽?duì)CTC中AR-V7檢測(cè)分析的性能具有高度的一致性，二者均可用于AR-V7的檢測(cè)。目前，El-Heliebi等[23]新提出基于細(xì)胞水平的原位鎖定探針技術(shù)較有優(yōu)勢(shì),通過(guò)將體內(nèi)可用的CTC富集裝置（CellCollector）與細(xì)胞鎖定技術(shù)相結(jié)合檢測(cè)AR-V7mRNA，并用CellSearch進(jìn)行免疫染色，分析AR-V7在核中的特異性定位。同時(shí)將原位檢測(cè)與英國(guó)NAGLE公司的parsortix系統(tǒng)相結(jié)合，根據(jù)CTC的大小和多形性進(jìn)行分類收集，觀察細(xì)胞角蛋白的狀態(tài)，從而對(duì)CTC的異質(zhì)性（從上皮細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞各階段的分化）進(jìn)行評(píng)估。該技術(shù)無(wú)需裂解CTC，以熒光信號(hào)來(lái)可視化和定量分析AR-V7的表達(dá)水平，同時(shí)定量CTC并觀察其異質(zhì)性，是AR-V7檢測(cè)技術(shù)的重要突破。

富集CTC檢測(cè)AR-V7相比其他手段高效快速、特異性高，但技術(shù)要求嚴(yán)格，且無(wú)CTC計(jì)數(shù)者無(wú)法對(duì)AR-V7的狀態(tài)和定量進(jìn)行確定。意大利的分子診斷與藥物遺傳研究部制定了一組標(biāo)準(zhǔn)化操作程序（SOP），從實(shí)驗(yàn)室和臨床的角度對(duì)AR-V7的檢測(cè)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)估驗(yàn)證[24]。該SOP對(duì)CT C富集和AR-V7檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范解決了批間變異、測(cè)定誤差、試劑運(yùn)輸（干冰運(yùn)輸）和儲(chǔ)存影響（-80℃）等問(wèn)題,以凍干法保存樣品可極大地改善CT C中AR-V7的穩(wěn)定性,減少實(shí)驗(yàn)室之間的質(zhì)量控制差異。此外，該SOP對(duì)結(jié)果的報(bào)告形式也提出建議：陽(yáng)性（>10拷貝/ml富集全血）或陰性（<10拷貝/ml富集全血）；AR-V7/AR-FL值僅適用于陽(yáng)性樣品。

2.3 全血中AR-V7的檢測(cè) 研究認(rèn)為全血中的A R-V7mRNA比CTC中更易檢測(cè),且在不同實(shí)驗(yàn)室之間有更高的再現(xiàn)性,甚至長(zhǎng)期儲(chǔ)存的全血樣本也可檢測(cè)[25]。液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR)是第三代 PC R技術(shù)（dPCR）與液滴微流控技術(shù)的結(jié)合，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于PCa的相關(guān)研究中。樣本溶液在微流控芯片中被高效精確地分成102~107個(gè)小液滴[26]，每個(gè)液滴包含至多一個(gè)目的基因,并作為獨(dú)立反應(yīng)單元各自進(jìn)行的PCR擴(kuò)增,以含有目標(biāo)基因的液滴發(fā)出熒光為陽(yáng)性,根據(jù)陽(yáng)性液滴比例和泊松分布對(duì)目的基因進(jìn)行精密的絕對(duì)定量。有研究[27]在21間國(guó)際實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部對(duì)dPCR檢測(cè)可變異序列的可重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證，確定了dPCR在各實(shí)驗(yàn)室間具有高度的可重復(fù)性，這說(shuō)明AR-V7分子診斷的應(yīng)用具備指導(dǎo)臨床治療的潛力。Seitz等[28]應(yīng)用高敏感的ddPCR對(duì)長(zhǎng)期儲(chǔ)存在生物樣本庫(kù)內(nèi)的85份CRPC全血樣本進(jìn)行AR-V7mRNA檢測(cè)，15例AR-V7呈高水平，且經(jīng)多變量邏輯回歸分析，AR-V7是PSA應(yīng)答的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。另外，Xichun等[29]用RT-PCR直接檢測(cè)保存在PAXgene?管中的46份CRPC全血AR-V7，陽(yáng)性率達(dá)67.53%。上述研究雖未考慮健康獻(xiàn)血者，但研究已表明[25]在健康獻(xiàn)血者外周血的4000個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中并未檢測(cè)到ARV7。Fangfang等[30]離心132例CRPC患者的全血并分離出單個(gè)核細(xì)胞，以ddPCR評(píng)估AR-V7在其中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示95%的患者AR-V7轉(zhuǎn)錄物均超過(guò)19拷貝/μgRNA。此外，研究者通過(guò)ddPCR在CRPC患者的血漿中也檢測(cè)到AR-V7,源自癌細(xì)胞釋放于血液中具有脂質(zhì)雙分子層的納米級(jí)細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，稱為血漿外泌體[31]。盡管全血標(biāo)本方便獲取，但有研究[32]比較了乙二胺四乙酸（EDTA）采血管、檸檬酸鹽采血管和含有防腐劑的采血管的有效性,最終只在前兩種采血管室溫儲(chǔ)存48h后仍可檢測(cè)到AR-V7，該結(jié)果為全血中AR-V7的檢測(cè)做了細(xì)節(jié)性提示。

全血中AR-V7的檢測(cè)來(lái)源簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)安全且具有很好的臨床應(yīng)用前景，然而，部分研究表明[33]AR-V7也可能存在于非惡性細(xì)胞 （如癌旁組織或良性腺體）中，但多數(shù)相關(guān)研究卻未對(duì)全血樣本的檢測(cè)進(jìn)行廣泛地驗(yàn)證。因此，該檢測(cè)手段在推廣應(yīng)用于臨床診療之前仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2.4 尿液中AR-V7的檢測(cè) 研究者[34]用放射電子顯微鏡觀察到PCa患者尿液中存在的EVs,并通過(guò)正丁醇提取到異常增加的尿囊泡相關(guān)性PSA，顯示了EVs對(duì)PCa患者潛在的診斷價(jià)值。尿液EVs可濃縮分子并保護(hù)其免受高RNA酶環(huán)境的影響，能提供關(guān)于整個(gè)泌尿系統(tǒng)甚至全身狀態(tài)的信息，甲基化DNA、miRNA、大量蛋白質(zhì)和腫瘤相關(guān)代謝產(chǎn)物等均被證明在尿囊泡中具有可測(cè)水平[35,36]。不同分離方法對(duì)尿EVs顯示出不同的親和力,但數(shù)據(jù)表明[37]應(yīng)用尿外泌體RNA分離試劑盒（NORGEN）進(jìn)行分離純化的EVs，其目的基因檢出率較高，尿液中的EVs也被證明存在可測(cè)的AR-V7。有研究[38]在14名CRPC患者的尿液EVs中檢測(cè)到高水平的AR-V7和低表達(dá)的AR-FL,而22名激素敏感型PCa患者的AR-V7呈低表達(dá)。該研究采用非侵入性尿液檢測(cè)的方法,用基于酶聯(lián)免疫吸附的納濾單元組成的微流體裝置分離EVs并快速富集，通過(guò)ddPCR定量AR-V7和AR-FL的絕對(duì)濃度 （每毫升拷貝數(shù)）。該研究首次報(bào)道了尿液中的EVs是分析AR-V7表達(dá)的可靠來(lái)源，這一無(wú)創(chuàng)性的方法或?qū)㈤_啟AR-V7檢測(cè)的新思路。但AR-V7的檢測(cè)將影響臨床決策,且以尿液為標(biāo)本檢測(cè)AR-V7的研究還較少,后續(xù)仍需要大量的驗(yàn)證研究以提供更多可靠的數(shù)據(jù)。

3 小結(jié)與展望

AR-V7是目前CRPC最具潛力的新生標(biāo)記物，但在正式應(yīng)用于臨床前，我們?nèi)孕柽M(jìn)行大規(guī)模的前瞻性研究對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。AR-V7的檢測(cè)手段利弊各異，尚未有數(shù)據(jù)對(duì)其進(jìn)行比較和統(tǒng)一，目前的檢測(cè)水平已經(jīng)打破組織活檢的單一格局，在AR-V7的檢測(cè)來(lái)源和檢測(cè)技術(shù)上都取得了新的突破。靈敏度和特異性更高的檢測(cè)手段能精確定量AR-V7的水平,使其更好地應(yīng)用在晚期PCa患者的診療優(yōu)化和預(yù)后評(píng)估中。然而，我們依舊面臨諸多挑戰(zhàn)，如何解決PCa異質(zhì)性對(duì)AR-V7特異性檢測(cè)的影響？檢測(cè)血液和尿液來(lái)源的AR-V7是否更高效合理？如何將檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)單化并得到最終標(biāo)準(zhǔn)以利于推廣應(yīng)用？相信隨著分子診斷、基因測(cè)序和生物信息等技術(shù)的進(jìn)步，在科研人員、臨床醫(yī)生和實(shí)驗(yàn)室專家的深入研究后，AR-V7的精確檢測(cè)將廣泛應(yīng)用于臨床并為CRPC患者提供更多益處。