酶解條件對(duì)菜籽粕水解得率的研究

李業(yè)祿，王麗娟， 汪晶晶，朱 晶，白 巖，涂向輝

（沈陽(yáng)師范大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

我國(guó)擁有豐富的菜籽資源，是世界公認(rèn)的菜籽生產(chǎn)大國(guó)。菜籽粕中含有豐富的蛋白質(zhì)，其中粗蛋白可達(dá)28%～40%[1-2]，菜籽中蛋白質(zhì)不但具有高含量的優(yōu)點(diǎn)，而且其氨基酸組成及氨基酸構(gòu)成比例合理[3]。但是菜籽中的蛋白不能被人體直接吸收利用，尤其是植酸和有害酚的存在，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不利影響，需要將這種蛋白質(zhì)水解成能夠被人體吸收利用的小分子才能發(fā)揮作用[4]，因此有必要利用酶工程技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)水解，使其能被人體充分吸收。但是，菜籽蛋白在水解過(guò)程中若水解不完全，很容易產(chǎn)生苦味[5]，不但味覺上不能被消費(fèi)者接受，其在人體內(nèi)的消化吸收也會(huì)大打折扣；同時(shí)，酶解過(guò)程中也會(huì)帶來(lái)菜籽的損失等問(wèn)題[6]。除此之外，傳統(tǒng)的酶解菜籽粕其水解度低，不能將菜籽粕較徹底地水解[7]。因此，以一種更有效、對(duì)菜籽損失更少的酶解手段對(duì)菜籽進(jìn)行酶解是很有必要的。試驗(yàn)將酶解菜籽粕性能良好的幾種酶進(jìn)行復(fù)合使用，不但可以更好地酶解菜籽粕，溶出菜籽粕中蛋白質(zhì)，且菜籽粕水分含量變化不大，總氮含量高，是一種有效的酶解菜籽粕的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菜籽粕，購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme）、中性蛋白酶、果膠酶，國(guó)藥提供。

1.2 主要試劑

濃硫酸（H2SO4）、硫酸銅（CuSO4）、硼酸（H2BO3）、氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）、混合指示劑（甲基紅、溴甲酚綠分別溶于不同比例甲醇溶液），均為分析純。

1.3 主要試驗(yàn)儀器

UV-1200S型紫外可見分光光度計(jì)、磁力攪拌器、天平、雷磁E-201-C型pH計(jì)、HH.S11-2型水浴鍋、水分測(cè)定儀、凱式定氮儀等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菜籽粕的蛋白酶分步酶解工藝過(guò)程[8]

將菜籽粕粉碎預(yù)處理并過(guò)40目篩，對(duì)篩下物進(jìn)行水分測(cè)定，并作為原料使用。將原料進(jìn)行浸泡并以50℃預(yù)煮，1 h后進(jìn)行冷卻，根據(jù)所選酶調(diào)節(jié)pH值，然后加入稀釋酶液，對(duì)原料進(jìn)行50℃恒溫酶解，酶解過(guò)程中不斷進(jìn)行pH值測(cè)定，并適當(dāng)添加酸堿液。一定時(shí)間后對(duì)原液進(jìn)行15 min沸水滅酶處理，冷卻后進(jìn)行離心。

1.4.2 單因素試驗(yàn)[9]

以菜籽粕酶解前后水分及水解度改變量為指標(biāo)，探究堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等酶種類及酶解時(shí)間對(duì)菜籽粕酶解效果的影響。

1.4.3 復(fù)合酶對(duì)菜籽粕酶解的影響[10]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以不同酶復(fù)合使用及作用時(shí)間探究對(duì)菜籽粕酶解作用的影響。

1.4.4 水分測(cè)定

水分測(cè)定儀對(duì)菜籽酶解前后水分進(jìn)行測(cè)定。

1.4.5 總氮的測(cè)定

采用凱氏定氮法[11]。

1.4.6 水解度計(jì)算

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

以SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素酶對(duì)菜籽粕酶解影響

原料液pH值調(diào)至8.5，恒溫振蕩1 h，加入堿性蛋白酶2 g，分別在50℃條件下反應(yīng)1 h（A1） 和2 h（A2）[12]，測(cè)定原料前后水分含量及水解度。

原料液pH值調(diào)至6.0，恒溫振蕩1 h，分別加入風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶2 g，分別在50℃條件下反應(yīng)1 h（B1，C1） 和2 h（B2，C2） ， 測(cè)定原料前后水分含量及水解度。

原料液pH值調(diào)至5.0，恒溫振蕩1 h，加入果膠酶 2 g，分別在 50℃條件下反應(yīng)1 h（D1） 和 2 h（D2），測(cè)定原料前后水分含量及水解度。

不同酶體系下酶解菜籽粕的水分和水解度見表1。

表1 不同酶體系下酶解菜籽粕的水分和水解度/%

表1顯示，加入各種單因素酶對(duì)菜籽粕酶解后水分影響不大，均為69%～79%，從水解度來(lái)看，酶解2 h相對(duì)于酶解1 h更徹底。如加入堿性蛋白酶（A1、A2） 1 h時(shí)水解度為6.96%，2 h時(shí)水解度為7.43%，可見酶解時(shí)間應(yīng)選擇2 h。從各酶體系水解度來(lái)看，堿性蛋白酶（A2為7.43%） 和果膠酶（D2為7.83%） （p＜0.05） 對(duì)菜籽粕的酶解更有效。

2.2 復(fù)合酶對(duì)菜籽粕酶解影響

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，堿性蛋白酶和果膠酶對(duì)菜籽粕酶解具有很好的效果，因此將堿性蛋白酶與果膠酶分別與剩下2種酶復(fù)合使用，探究其對(duì)菜籽粕酶解的影響，并探究堿性蛋白酶與果膠酶復(fù)合對(duì)菜籽粕酶解的影響。

不同復(fù)合酶體系下酶解菜籽粕的水分和水解度見表2。

表2 不同復(fù)合酶體系下酶解菜籽粕的水分和水解度/%

表2顯示，雖然復(fù)合酶的使用均提高了菜籽粕的水解度，但A2B2組，即堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合使用時(shí)菜籽粕的水解度最大為24.2%，比預(yù)想的單因素試驗(yàn)組最好的堿性蛋白酶和果膠酶復(fù)合水解度（10.48%） 要高得多。可見，復(fù)合酶的使用可以有效提高菜籽粕的水解度。

試以3種酶進(jìn)行復(fù)合使用，以水解度為主要衡量指標(biāo)進(jìn)一步探究其對(duì)菜籽粕水解度的影響。

不同復(fù)合酶體系對(duì)菜籽粕水解度的影響見圖1。

圖1表明，復(fù)合酶體系為ABC即堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)合使用時(shí)，菜籽粕水解度最高，為27.3%，此時(shí)菜籽粕的水分為79.37%，堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶與中性蛋白酶這3種酶復(fù)合使用對(duì)菜籽粕的酶解相對(duì)來(lái)說(shuō)更有效。

2.3 總氮測(cè)定

對(duì)復(fù)合效果最好的3種復(fù)合酶水解后的菜籽粕進(jìn)行氮含量測(cè)定，結(jié)果顯示總氮量達(dá)93.28%。最終酶體系的選擇為：將原料液調(diào)至適當(dāng)pH值，依次加入2 g堿性蛋白酶、2 g風(fēng)味蛋白酶、2 g中性蛋白酶（各酶pH值有所不同），分別進(jìn)行2 h菜籽粕的酶解反應(yīng)，試驗(yàn)過(guò)程中注意把握pH值變化。

3 結(jié)論

以菜籽粕為主要原料，采用單因素試驗(yàn)探究堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶及果膠酶對(duì)菜籽粕的水解度影響，并對(duì)這幾種沒用正交分解法進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)，得到水解菜籽粕的最優(yōu)比例。在原料液調(diào)至適當(dāng)pH值條件下，依次加入堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶及中性蛋白酶各2 g，分別對(duì)菜籽粕在50℃下水解2 h，所得菜籽粕水解度為27.3%，此時(shí)水解度最高，菜籽粕水分為79.37%，總氮含量為93.28%。該過(guò)程操作簡(jiǎn)單、效果良好，可廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[13]。