索拉非尼聯(lián)合三氧化二砷對肝癌表面耐藥蛋白P-糖蛋白表達的影響及療效觀察

林榕生 吳楚海 王濤 李懷 陳榮斌 陸美華 李志蘭

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)為高致死率的惡性腫瘤，近年來，隨著環(huán)境污染、黃曲霉素、乙型肝炎病毒感染等問題的加劇，我國已成為全球肝癌發(fā)病率及病死率最高的國家[1]。HCC病情進展快，而且復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，超過80%患者確診時已達晚期或已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，化療是晚期HCC綜合治療的重要手段之一，但肝癌細胞對化療藥物的多藥耐藥嚴重影響了化療效果，約70%化療后短時間內(nèi)即發(fā)生耐藥表現(xiàn)。研究表明，肝癌多藥耐藥在形成過程中P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-GP)表達異常，P-GP與肝癌細胞多藥耐藥密切相關(guān)[2,3]。索拉非尼為多靶點酪氨酸激酶抑制劑，為治療晚期HCC的一線靶向藥物。目前，較多動物或體外實驗證實索拉非尼聯(lián)合三氧化二砷對肝細胞癌肺轉(zhuǎn)移及血管生成具有明顯的抑制作用[4,5]，但應(yīng)用于臨床的研究筆者所見鮮有報道。本研究中索拉非尼聯(lián)合三氧化二砷治療晚期HCC，旨在探討其臨床療效及對耐藥蛋白P-GP表達的影響，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1～12月我院腫瘤內(nèi)科收治的90例初治原發(fā)性肝癌患者，男54例，女36例；年齡29～75歲，平均年齡(50.2±1.1)歲；TNM分級[6]均為Ⅳ期；按患者入院順序隨機分成2組，其中觀察組35例，男21例，女14例；年齡29～73歲，平均年齡(50.5±1.8)歲；肝功能Child-Pugh分級[7]：A級31例,B級4例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例。對照組55例，其中男33例，女22例；年齡29～75歲，平均年齡(51.3±1.4)歲；肝功能Child-Pugh分級：A級48例,B級7例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。2組患者年齡、性別、臨床分期、肝功能Child-Pugh分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究所有患者及家屬對研究內(nèi)容知情，且均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①經(jīng)影像學或肝臟穿刺活檢診斷為原發(fā)性肝癌者[8]；②TNM分期為Ⅳ期，且初次接受治療者；③肝功能Child-Pugh分級≤9分者；④預(yù)計生存期≥3 個月者。

1.2.2 排除標準：①肝功能失代償或合并慢性肝性腦病；②合并其他惡性腫瘤者；③心臟病、感染及腎功能不全者；④孕婦或哺乳期女性。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批。

1.3 治療方法 所有患者采用肝動脈化療栓塞治療，檢查確認無砷類藥物的禁忌證后，對照組患者化療期間給予三氧化二砷注射液(北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))10 mg/次，1次/d，靜脈滴注，每次滴注3～4 h，連用1～4 d為1個療程，間歇2周后重復(fù),至少使用4療程。觀察組在對照組治療基礎(chǔ)上，在化療后5 d給予口服甲苯磺酸索拉非尼片(德國BayerPharmaAG生產(chǎn))0.4 g/次，2次/d，囑患者空腹或伴低脂、中脂飲食服用；4周為1個療程，連續(xù)服用4個療程，每4～6周回訪1次。

1.4 觀察指標 (1)肝組織P-GP表達水平：本研究所有無法手術(shù)原發(fā)性肝癌患者，病理診斷取材前提下，2組在治療前及治療4個療程后，采集肝癌組織、癌旁組織(癌組織旁1 cm)、正常組織(癌組織旁3～5 cm以外或最遠處)，并拍攝記錄標本外觀取材部位。鮮肝組織用10%中性甲醛液固定，石蠟包埋，制成厚度4 μm 的組織切片備用。采用免疫組化S-P二步法進行檢測,用0.01 mol/L pH值 6.0檸檬酸鹽緩沖液進行高壓抗原修復(fù),用已知P-GP陽性切片(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供)為陽性對照,磷酸鹽緩沖液(PBS)代替第一抗體作為陰性對照。結(jié)果判定標準：P-GP陽性染色為橙黃色顆粒狀，每張切片在光鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個瘤細胞，由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進行雙盲結(jié)果判定著色強度，并參照：基本未見陽性細胞著色為-，記為0分；染色淺黃色未見明顯有色顆粒者為+，記為1分；染色棕黃色且可見細有色顆粒者為++，記為2分；色深棕色且可見粗大有色顆粒者為+++，記為3分；并計算陽性性細胞占比：0分：0；1分：<33%；2分：3%～66%；3分：>66%；二者之和≤2分定義為低表達，3～6分為高表達[9]；(2)近期療效：2組患者治療前后均經(jīng)彩超及CT檢查，治療后根據(jù)實體瘤近期客觀療效評定標準[10]，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)及進展(PD)4個，計算有效率(RR)=CR+PR，疾病控制率(DCR)=CR+PR+SD；(3)遠期療效及不良反應(yīng)：采用門診或電話方式隨訪至2019年2月25日，比較2組患者疾病進展時間(TTP)及1 年生存率；并參照美國國立癌癥研究所NCI-CTC 3.0版[11]評價隨訪期間藥物不良反應(yīng)發(fā)生情況。

2 結(jié)果

2.1 2組肝組織P-GP表達水平 癌組織中P-GP主要表達于細胞膜及細胞漿中，呈棕黃色；對照組癌組織、癌旁組織及正常組織中P-GP表達的陽性率分別為69.09%、32.73%、16.36%，與觀察組各組織中P-GP表達的陽性率(68.57%、28.57%、14.29%)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；給予不同方案治療后，對照組患者各組織中P-GP表達陽性率較治療前下降，但差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.682，P=0.263；χ2=3.153，P=0.508；χ2=0.936，P=0.863)；觀察組患者癌組織及癌旁組織P-GP表達陽性率較治療前明顯降低(χ2=5.824，P=0.022；χ2=6.182，P=0.014)，但正常組織中P-GP表達陽性率治療前后差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.252，P=0.093)；觀察組患者癌組織及癌旁組織中P-GP表達陽性率均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但2組正常組織中P-GP表達陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組治療前后不同組織P-GP陽性表達結(jié)果比較 例(%)

注：與治療前比較，*P<0.05

2.2 2組近期臨床療效比較 觀察組總有效率及疾病控制率(40.00%、85.71%)明顯高于對照組(23.64%、60.00%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者臨床療效比較 例(%)

2.3 2組遠期療效療效比較 截至末次隨訪日期2019年2月25日，其中對照組失訪2例，隨訪53例，隨訪率為96.36%；觀察組失訪1例，隨訪34例，隨訪率為97.14%；觀察組患者中位TTP為6.8個月，12個月生存率為57.14%；對照組患者中位TTP為6.2個月，12個月生存率為52.73%；觀察組中位TTP及12個月生存率均高于對照組，但2組差異無統(tǒng)計學意義(t=2.937，P=0.127；χ2=3.054，P=0.084)。

2.4 2組不良反應(yīng)發(fā)生情況分析 2組患者主要出現(xiàn)消化道反應(yīng)、手足及皮膚、骨髓抑制等不良反應(yīng)，2組不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 2組治療后不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 例(%)

3 討論

研究表明，肝癌細胞內(nèi)多藥耐藥基因(MDR1)編碼的糖蛋白(P-GP)過度表達是引起肝癌細胞多藥耐藥的主要原因[12]，并有研究闡明P-GP參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[13]。 P-GP是一種跨膜糖蛋白,屬于ABC轉(zhuǎn)運超蛋白家族，在ATP參與下在細胞膜上形成ATP依賴性流出泵，當抗腫瘤藥物進入時，將親脂性藥物泵出胞外，導(dǎo)致細胞內(nèi)藥物濃度低于有效劑量，引發(fā)肝癌細胞耐藥[14,15]。在肺癌、胰腺癌治療中，通過抑制腫瘤細胞P-GP的表達，可明顯降低腫瘤細胞耐藥率，為肝癌的治療提供了新的思路。

索拉非尼為多靶點酪氨酸激酶抑制劑，其通過的抑制RAF/MEK/ERK通路中Raf激酶活性，從而阻斷該通路信號介導(dǎo)的一系列反應(yīng)，可有效抑制腫瘤細胞增殖；同時通過抑制VEGFR、PDGFR-β等新生血管生成因子，從而抑制腫瘤新生血管形成，延長患者生存期，是治療原發(fā)性肝癌臨床治療的一線分子靶向藥物。三氧化二砷為凋亡誘導(dǎo)劑，可有效抑制肝癌細胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。研究顯示，單用索拉非尼或三氧化二砷用于治療原發(fā)性肝癌有效率仍不容樂觀[16，17]。林曉花等[16]研究顯示，采用索拉非尼聯(lián)合肝動脈的栓塞化療(TACE)治療晚期肝癌客觀有效率為38.2%，疾制病率為69.6%；而顏廷華等[17]采用三氧化二砷聯(lián)合TACE治療中晚期原發(fā)性肝癌總有效率為20.0%，疾病控制率為80.0%；本研究采用索拉非尼聯(lián)合三氧化二砷治療晚期原發(fā)性肝癌，結(jié)果顯示總效率及疾病控制率分別40.00%、85.71%，明顯高于單用三氧化二砷治療組。本研究總效率及疾病控制率均優(yōu)于單用索拉非尼或三氧化二砷治療肝癌的相關(guān)研究。同時，本研究結(jié)果顯示，索拉非尼聯(lián)合三氧化二砷治療組中位TTP為6.8個月，12個月生存率為57.14%，明顯優(yōu)于單用三氧化二砷治療組，且出現(xiàn)消化道反應(yīng)不良反應(yīng)、手足及皮膚反應(yīng)、骨髓抑制等不良反應(yīng)與單用三氧化二砷治療組無明顯差異，提示索拉非尼聯(lián)合三氧化二砷治療晚期肝癌臨床療效顯著，且安全性較高。

另外，本研究結(jié)果顯示，癌組織、癌旁組織及正常組織中P-GP表達的陽性率分別為69.09%、32.73%、16.36%，與周業(yè)庭等[18]研究結(jié)果基本一致。給予2組不同用藥方案治療后，索拉非尼聯(lián)合三氧化二砷治療組患者癌組織及癌旁組織P-GP表達陽性率呈明顯降低，且降低程度大于單用三氧化二砷治療組，但2組患者治療前后正常組織中P-GP表達均無明顯變化。提示聯(lián)合索拉非尼后，可明顯改善肝癌晚期患者癌組織及癌旁組織中P-GP過表達，提高臨床療效。研究顯示，索拉非尼可明顯降低人肝癌多藥耐藥細胞BEL-7402/FU中P-GP表達的表達水平[19]；同時，喻喆等[20]體外實驗表明，索拉非尼可顯著降低人肝癌耐氟尿嘧啶細胞株BEL-7402/ 5-FU細胞對氟尿嘧啶、表柔比星及紫杉醇的耐藥性，并認為索拉非尼逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥性可能是通過下調(diào)P-GP的表達實現(xiàn)的。本研究給予晚期肝癌患者給予索拉非尼聯(lián)合三氧化二砷治療后，療效明顯提升，且癌組織及癌旁組織P-GP表達明顯下調(diào)，可能是索拉非尼作為P-GP轉(zhuǎn)運底物，通過抑制P-GP或者其他ABC轉(zhuǎn)運蛋白功能，增加肝癌細胞內(nèi)化療藥物濃度，從而逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥性。

綜上所述，索拉非尼聯(lián)合三氧化二砷治療原發(fā)性肝癌臨床療效顯著，且可明顯降低癌組織、癌旁組織中P-GP的表達，值得臨床進一步推廣應(yīng)用。另外，本研究為單中心取樣，且總體樣本量較小，隨訪時間有待延長，對本研究結(jié)果造成一定影響。后續(xù)擬擴大樣本量，進一步探討索拉非尼逆轉(zhuǎn)肝癌細胞多藥耐藥性的作用機制。