大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠淋巴細(xì)胞功能的影響

鄒蕾 黃志遠(yuǎn) 楊橋 金紅旭

作為一種常見的外科急腹癥，重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)的主要病理特征為胰腺彌漫性出血和組織壞死，并伴有全身性免疫功能紊亂，其發(fā)病急驟、病情兇險(xiǎn)、進(jìn)展快、預(yù)后差、病死率高[1,2]。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，但有觀點(diǎn)認(rèn)為胰腺消化酶的激活導(dǎo)致胰腺自身發(fā)生消化，期間胰腺細(xì)胞和間質(zhì)出現(xiàn)水腫，使全身炎性反應(yīng)瀑布系統(tǒng)被激活，最終引發(fā)全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory respone syndrome,SIRS)以及多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)而導(dǎo)致機(jī)體死亡[3,4]。免疫過激引發(fā)的全身炎性反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征所致的早期死亡，以及免疫抑制引起感染加重所致的疾病后期死亡是該病死亡的兩個高峰[5]。作為中草藥大黃的有效成分，大黃素(Emodin，EMO，1,3,8-三羥基-6-甲基-9,10-蒽醌)是一種廣泛存在于大黃、蘆薈、虎杖等蓼科藥用植物中的羥基蒽醌類化合物。近年來大黃素被證實(shí)對重癥急性胰腺炎有較好的治療效果[6]。然而，關(guān)于其對淋巴細(xì)胞影響的報(bào)道筆者所見仍不多見，因此，本研究以重癥急性胰腺炎大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討大黃素對淋巴細(xì)胞功能的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑與儀器 45只SPF 級健康雄性SD大鼠，采購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,合格證號SCXK(京)2012-0001，體重200～240 g，于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司采購，于60%～65%濕度、20～24℃室溫，日光燈每天照射12 h以維持晝夜循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間讓其自由飲水飲食。牛磺膽酸鈉和大黃素均于美國Sigma公司采購；CD3FITC、CD8PE、CD45Percp、CD4APC、CD16+56PE、CD19APC抗體、PE熒光直標(biāo)大鼠Foxp3 檢測試劑盒、大鼠 Bregs 流式試劑盒均購自美國eBscience公司；大鼠淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)?；白介?0(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)檢測試劑盒購自Abcam。OLYMPUS BX50型光學(xué)顯微鏡；Eppendorf Centrifuge 5430R/5417R型離心機(jī)；流式細(xì)胞儀；Biosystems 7500 Fast Real-Time PGR System型PCR儀。

1.2 重癥急性胰腺炎大鼠模型的建立 術(shù)前不限制飲水，但禁食12 h，稱重后腹腔注射10%水合氯醛溶液以麻醉大鼠，之后將大鼠固定于手術(shù)臺，腹部剪毛并常規(guī)消毒，鋪巾，于上腹劍突下作切口進(jìn)入腹腔，使十二指腸和胰膽管暴露，將胰膽管遠(yuǎn)端膽管近肝門處用無損傷血管夾雙重夾住，于十二指腸乳頭附近將0.45 mm 頭皮針經(jīng)十二指腸外壁穿入腸腔，逆行插入胰膽管末端并用血管夾將枕頭固定。用微量泵以 0.1 ml/min的速度將新鮮配置的5%牛黃膽酸鈉溶液(1 ml/kg)推注至主胰管內(nèi)，完成后觀察5 min，待周圍組織出現(xiàn)棕紅色改變即可拔出頭皮針，無損傷血管夾繼續(xù)夾閉 5 min以使各胰腺小葉內(nèi)充分進(jìn)入牛磺膽酸鈉溶液，取下血管夾，將十二指腸復(fù)位并確認(rèn)腹腔無活動性出血，關(guān)腹縫合。假手術(shù)組除不泵入?；悄懰徕c外其他操作均相同。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥 45只SD大鼠隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組、SAP模型組和EMO治療組，每組15只。給藥方式：EMO治療組建模后1 h腹腔注射大黃素；假手術(shù)組和SAP模型組腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.4 HE染色觀察胰腺組織病理學(xué)變化 取大鼠胰腺組織置于液氮中冷凍后用冰凍切片機(jī)切片，固定，60℃蘇木精染色，流水沖洗，加1%鹽酸乙醇，促藍(lán)液返藍(lán)，0.5%曙紅液染色，依次經(jīng)梯度乙醇脫水及二甲苯透明，最后用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 流式細(xì)胞儀分析全血中Bregs細(xì)胞含量 治療后24 h采集各組大鼠新鮮全血并各取0.5 ml，分別加適量1×紅細(xì)胞裂解液置于室溫下靜置20 min，離心棄上清，加5%BSA混勻后4℃作用1 h，加細(xì)胞染色液清洗，離心棄上清，加大鼠Bregs流式試劑盒抗體，避光孵育40 min，之后細(xì)胞染色液清洗，離心棄上清，置于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。

1.7 ELISA檢測IL-10、TGF-β1 采集小鼠全血，分離血清，采用ELISA試劑盒檢測IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β1 (TGF-β1)水平，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 RT-qPCR檢測淋巴細(xì)胞中Foxp3、CTLA-4的mRNA 取適量分離的淋巴細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞中總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，以該cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，檢測組織中Foxp3、CTLA-4的表達(dá)水平。同時以β-actin作為內(nèi)參基因。每個樣本均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠胰腺組織病理學(xué)變化 假手術(shù)組大鼠胰腺組織未見出血，白細(xì)胞浸潤、壞死及破裂，小葉僅出現(xiàn)輕度水腫。SAP模型組可見腺泡完整性被破壞，腺泡細(xì)胞出血、水腫、壞死以及炎性細(xì)胞浸潤，腺泡液外溢，胰腺小葉間隙增寬。EMO治療組大鼠胰腺組織病理變化較SAP模型組顯著改善，向假手術(shù)組發(fā)展。見圖1。

假手術(shù)組SAP模型組EMO治療組

圖1 3組大鼠胰腺組織病理學(xué)變化(HE染色×200)

2.2 3組T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+和CD8+)百分比 與假手術(shù)組相比，SAP模型組大鼠全血中CD4+細(xì)胞亞群百分比、CD4+/CD8+比值均降低，CD8+細(xì)胞亞群百分比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SAP模型組相比，EMO治療組CD4+細(xì)胞亞群百分比、CD4+/CD8+比值顯著升高，CD8+細(xì)胞亞群百分比顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+和CD8+)百分比

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與SAP模型組比較，#P<0.05

2.3 3組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)含量 SAP模型組大鼠Tregs細(xì)胞比例較假手術(shù)組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EMO治療組Tregs細(xì)胞比例較SAP模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SAP模型組大鼠Bregs細(xì)胞比例較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)；EMO治療組Bregs細(xì)胞比例較SAP模型組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組Tregs和Bregs含量

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與SAP模型組比較，#P<0.05

2.4 3組IL-10和TGF-β1水平 與假手術(shù)組相比，SAP模型組大鼠血清中IL-10和TGF-β1水平顯著降低(P<0.05)；EMO治療組IL-10和TGF-β1水平高于SAP模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.5 3組淋巴細(xì)胞中Foxp3 、CTLA-4的mRNA 表達(dá) SAP模型組Foxp3 mRNA及CTLA-4 mRNA水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；與SAP模型組相比，EMO治療組Foxp3 mRNA及CTLA-4 mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表3 3組大鼠血清中IL-10和TGF-β1水平

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與SAP模型組比較，#P<0.05

表4 各組淋巴細(xì)胞中Foxp3、CTLA-4的mRNA 相對表達(dá)量

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與SAP模型組比較，#P<0.05

3 討論

全身性免疫功能紊亂是重癥急性胰腺炎的伴發(fā)癥狀，病程早期常因免疫過激引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合癥，后期則因免疫抑制加重感染，最終都導(dǎo)致了死亡的發(fā)生。以往研究證實(shí)大黃素具有抑菌抗炎、清除氧自由基和抗氧化、保護(hù)肝腎、利膽利尿、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[7]。在重癥急性胰腺炎中，大黃素可降低血清及胰腺組織中的白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha-α，TNF-α)等炎性因子水平，抑制胰酶釋放，保護(hù)腸黏膜，減輕對腎和心肌的損傷[8]。

本研究經(jīng)膽胰管逆行推注?；悄懰徕c建立重癥急性胰腺炎大鼠模型，同時給予腹腔注射大黃素，HE染色發(fā)現(xiàn)SAP模型組大鼠胰腺組織出現(xiàn)明顯病理變化，EMO治療組病理變化顯著改善，表明SAP大鼠模型建立成功，且證實(shí)大黃素對大鼠重癥急性胰腺炎有治療作用，可減輕胰腺組織的病理損傷。在機(jī)體炎性反應(yīng)中，淋巴細(xì)胞不僅能通過促進(jìn)免疫反應(yīng)來清除病原微生物，還發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的功能，對過強(qiáng)的免疫應(yīng)答具有抑制作用。作為淋巴細(xì)胞的主要組分之一，T細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫，在成熟的T細(xì)胞表面均有CD3分子表達(dá)，但CD4、CD8卻不同時表達(dá)，因此成熟的T細(xì)胞可被分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞兩個亞群，兩者的含量及比值常用來反映機(jī)體的免疫功能[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)SAP模型組大鼠CD4+T細(xì)胞含量及CD4+/CD8+比值均下降，EMO治療組則顯著升高，提示SAP模型組大鼠免疫功能受到抑制，EMO可提高機(jī)體免疫功能，從而減輕病理癥狀。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)在微生物感染、過敏反應(yīng)、移植耐受及腫瘤免疫中均發(fā)揮重要作用。免疫抑制性和免疫無能性是Treg細(xì)胞的兩大特性，其免疫抑制性的主要表現(xiàn)為，經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號刺激激活的Treg對CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的活化和增殖具有抑制作用，并且無MHC限制性，同種同型或同種異型T細(xì)胞的增殖均可被抑制[11]；其免疫無能性的主要表現(xiàn)為，IL-2特異性抗原和抗原提呈細(xì)胞(APC)的刺激使Treg處于低反應(yīng)狀態(tài)，但I(xiàn)L-2高濃度時Treg在TCR刺激下則發(fā)生活化并增殖[12]。有效控制病原體T細(xì)胞反應(yīng)之間的平衡以及調(diào)節(jié)導(dǎo)致嚴(yán)重炎癥和組織破壞的過度T細(xì)胞反應(yīng)是Treg最主要的功能。Treg過多或過少均引起免疫平衡失調(diào)，病情加重，因此Treg對機(jī)體免疫平衡具有重要作用[13]。文獻(xiàn)報(bào)道，Treg細(xì)胞功能增強(qiáng)或數(shù)量增加均可使炎性反應(yīng)減輕，然而對病原體的控制能力也降低。Foxp3m RNA及其編碼的蛋白質(zhì)于Treg上特異性表達(dá)，且介導(dǎo)Treg的表型、發(fā)育、活性及功能，F(xiàn)oxp3穩(wěn)定且持續(xù)性高表達(dá)是Treg發(fā)揮正常功能活性的必備條件，因此Foxp3被作為Treg的特征性標(biāo)志[14]。Treg免疫抑制性主要是通過分泌抑制性細(xì)胞因子及細(xì)胞接觸等方式非特異性抑制CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖活化。膜表面分子CTLA-4能為T淋巴細(xì)胞的活化提供第二信號，以阻斷其協(xié)同刺激通路，因而發(fā)揮介導(dǎo)Treg細(xì)胞接觸抑制的作用[15]。淋巴細(xì)胞凋亡是目前公認(rèn)的導(dǎo)致膿毒癥免疫功能紊亂的主要原因，尤其是CD4+T淋巴細(xì)胞過度凋亡引起的免疫抑制[16]。本研究發(fā)現(xiàn)SAP模型組大鼠Tregs細(xì)胞比例較假手術(shù)組升高，EMO治療組Tregs細(xì)胞比例較SAP模型組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SAP模型大鼠的Treg比例增加提示其功能活性強(qiáng)且對機(jī)體具有免疫抑制性，可能是CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡增加使其比例升高；EMO使 Treg比例降低，分析原因可能是EMO促進(jìn)了Treg凋亡或抑制了其他T淋巴細(xì)胞凋亡。Foxp3和CTLA-4變化與Treg一致，進(jìn)一步證實(shí)Treg在SAP大鼠中具有免疫抑制作用，而EMO則可減輕這種免疫抑制，對SAP起到治療作用。

調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cell，Bregs)通過分泌抑制性抗體或抑制性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，抑制過度炎性反應(yīng)，參與機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，在免疫功能紊亂、自身免疫病及移植排斥等狀態(tài)下亦發(fā)揮重要作用[17]。研究證實(shí)Bregs是分泌IL-10和TGF-β1的主要細(xì)胞，且其調(diào)節(jié)作用與兩種細(xì)胞因子密切相關(guān)[18]。小鼠體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Bregs降低腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子的表達(dá)是通過分泌IL-10以使細(xì)胞表面MHCⅡ類分子的表達(dá)減少。Bregs在炎癥環(huán)境及細(xì)胞因子下被激活后才會大量分化并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，Bregs活化后可上調(diào)Tregs表面抗原以使Tregs發(fā)生改變，T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥進(jìn)而轉(zhuǎn)化為自限性炎癥，最終導(dǎo)致自身免疫被抑制[19]。Bregs通過增加Tregs上Foxp3和CTLA-4的表達(dá)且依靠細(xì)胞間直接接觸進(jìn)而誘導(dǎo)Tregs的產(chǎn)生[20]。本研究中，SAP模型大鼠Bregs細(xì)胞比例較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)；EMO治療組較SAP模型組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IL-10和TGF-β1分泌水平與Bregs細(xì)胞比例變化一致。推測可能是重癥急性胰腺炎引起機(jī)體免疫功能嚴(yán)重紊亂，Bregs的激活受到抑制，含量降低，分泌及釋放的IL-10和TGF-β1少，以致于無法及時糾正過度炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大量炎性因子的釋放進(jìn)一步對多器官造成損傷；EMO可能是通過促進(jìn)Bregs的激活，加大了IL-10和TGF-β1的分泌及釋放，進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)，利于機(jī)體恢復(fù)。

綜上所述，大黃素對重癥急性胰腺炎具有治療作用，可能是通過提高CD4+T細(xì)胞含量及CD4+/CD8+比值使機(jī)體免疫功能增強(qiáng)，或者通過降低Treg比例減輕機(jī)體免疫抑制狀態(tài)，以及增加Bregs比例促進(jìn)IL-10和TGF-β1的分泌及釋放進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)。