晚期宮頸癌患者HIF-1α、HIF-2α及ERCC-1蛋白檢測(cè)的臨床意義

袁小慶 邢益祥 康敏

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，主要包括鱗癌、腺癌和腺鱗癌三種病理類型，晚期多可通過淋巴系統(tǒng)向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。雖然近年來持續(xù)突破的研究使得宮頸癌的發(fā)病率和死亡率都大大下降，但宮頸癌仍然是困擾女性健康的重要疾病，并且近年來，宮頸癌的發(fā)病不斷向年輕化發(fā)展[2]。因此，進(jìn)一步研究宮頸癌分子生物學(xué)水平的相關(guān)發(fā)病機(jī)制對(duì)宮頸癌的臨床治療具有重要意義。由于實(shí)體腫瘤的發(fā)展過程中普遍存在低氧環(huán)境，HIF基因的表達(dá)已被證實(shí)與諸多腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性[3]。臨床上對(duì)于早期宮頸癌患者，主要采用手術(shù)治療，而對(duì)于中晚期的患者，多采用放療和化療。近年來，臨床上開始采用手術(shù)聯(lián)合術(shù)前新輔助化療對(duì)晚期宮頸癌患者進(jìn)行治療，但是新輔助化療對(duì)患者的療效受多種因素的影響[4]。據(jù)報(bào)道，ERCC-1基因表達(dá)分型是影響治療效果的重要因素之一[5]。故本次試驗(yàn)設(shè)計(jì)一方面以晚期宮頸癌患者和宮頸良性病變患者進(jìn)行對(duì)照，分析HIF-1α、HIF-2α在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用和兩者之間的相關(guān)性，另一方面根據(jù)宮頸癌患者ERCC-1基因的分型的不同，分析ERCC-1基因的表達(dá)對(duì)于新輔助化療治療效果的影響，以期為臨床評(píng)估宮頸癌患者病情和選擇治療方法提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年8月至2016年2月收治的晚期宮頸癌患者30例(其中，ERCC-1基因表達(dá)為C/C型和T/T型的各15例)，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)組織病理學(xué)明確診斷為宮頸癌，根據(jù)國(guó)際科婦科聯(lián)盟分期標(biāo)準(zhǔn)分期為Ⅲ-Ⅳ期[6]；(2)尚未接受手術(shù)、化療或放療；(3)外周血ERCC-1基因表達(dá)為C/C型或T/T型；(4)患者年齡>18歲；(5)患者知情本研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)無新輔助化療指征的患者；(2)合并嚴(yán)重的心、腦血管系統(tǒng)疾病以及肝、腎、肺等實(shí)質(zhì)性臟器組織疾病的患者；(3)妊娠期或哺乳期的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。另選取同時(shí)我院收治的宮頸良性病變患者30例，將宮頸癌患者作為觀察組，良性病變患者作為對(duì)照組。2組患者的年齡、BMI等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)觀察組患者外周血ERCC-1基因表達(dá)不同，將觀察組患者分為C組和T組，每組15例，2組患者的年齡、BMI和病理分型等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 C組和T組患者一般資料情況 n=15

1.2 方法

1.2.1 HIF-1α、HIF-2α基因表達(dá)的檢測(cè)：采用RT-PCR法，引物由長(zhǎng)豐生物科技有限公司提供，標(biāo)本保存環(huán)境為-80℃，碾磨時(shí)也在冰上進(jìn)行，先提取總的RNA并檢測(cè)濃度，再轉(zhuǎn)換成cDNA反應(yīng)體系，在37℃條件下孵育60 min。孵育完成后完成40個(gè)PCR循環(huán)，染料采用SYBR Green熒光染料，根據(jù)收集到的熒光信號(hào)來分析結(jié)果。

1.2.2 HIF-1α、HIF-2α蛋白的檢測(cè)：采用免疫組化法，試劑盒購于北京中杉金橋公司，按照說明書對(duì)標(biāo)本進(jìn)行切片、固定，并經(jīng)一抗和二抗孵育后，用二氨基聯(lián)苯胺顯色2 min，蘇木精復(fù)染30 s，脫水后封片。陽性表達(dá)為棕黃色顆粒。

1.2.3 新輔助化療：2組患者服用醋酸地塞米松片(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格：0.75 mg/片)1片，每6小時(shí)1次，連服2次。在用化療藥物前30 min 給予鹽酸苯海拉明注射液(河南天方藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格1 ml∶20 mg)1支進(jìn)行預(yù)處理，化療藥物用量為：紫杉醇注射液(上海新亞藥業(yè)有限公司，規(guī)格5 ml∶30 mg)150 mg/m2，順鉑注射液(云南個(gè)舊生物藥業(yè)有限公司，規(guī)格6 ml∶30 mg)75 mg/m2。1個(gè)化療周期為21 d，共化療6個(gè)周期。

1.3 觀察指標(biāo) (1)2組患者的HIF-1α、HIF-2α基因在病理組織中的表達(dá)；(2)2組患者的HIF-1α、HIF-2α蛋白的表達(dá)；(3)不同ERCC-1基因型患者化療療效及預(yù)后情況比較；(4)HIF-1α、HIF-2α以及ERCC-1蛋白與患者貧血、化療后中位PFS和中位TTP的相關(guān)性分析。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.4.1 HIF-1α、HIF-2αmRNA：測(cè)量觀察組和對(duì)照組HIF-1α、HIF-2αmRNA的表達(dá)量。

1.4.2 HIF-1α、HIF-2α蛋白表達(dá)計(jì)分：由富有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師制定積分表準(zhǔn)：陽性細(xì)胞百分比：以1%、10%、50%、80%為分界點(diǎn)，個(gè)各區(qū)間分別記0、1、2、3、4分；著色強(qiáng)度：弱中強(qiáng)分別記1、2、3分。兩項(xiàng)分值相加作為最終計(jì)分。1分為陰性，2～3分為弱陽性，4～5分為陽性，6～7分為強(qiáng)陽性。陽性率=(弱陽性+陽性+強(qiáng)陽性)/總例數(shù)×100%。

1.4.3 療效標(biāo)準(zhǔn)：近期療效分為：①完全緩解：病灶消失且無新病灶出現(xiàn)，維持>4周；②部分緩解病灶最大直徑之和減少≥30%，維持>4周；③穩(wěn)定：病灶最大直徑之和減少<30%或增大<20%；④進(jìn)展：病灶最大直徑之和增大≥20%，或者出現(xiàn)新的病灶?？傆行?(完全緩解例數(shù)+部分緩解例數(shù))/30×100%。

2 結(jié)果

2.1 2組患者組織中HIF-1α、HIF-2α基因的表達(dá) 觀察組HIF-1αmRNA、HIF-2αmRNA的表達(dá)量分別為(9.12±0.64)、(8.98±0.77)，對(duì)照組為(7.13±0.33)、(7.02±0.15)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 2組患者HIF-1α、HIF-2α蛋白表達(dá) 觀察組患者HIF-1α、HIF-2α蛋白表達(dá)陽性率(63.33%、70.00%)均明顯高于對(duì)照組(16.67%、13.33%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、3。

表2 2組患者HIF-1α蛋白表達(dá)比較 n=30，例(%)

表3 2組患者HIF-2α蛋白表達(dá)比較 n=30，例(%)

2.3 不同ERCC-1基因型患者化療效果及預(yù)后比較 C組和T組的近期療效總有效率分別為80.00%、33.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組的中位生存期、中位進(jìn)展時(shí)間以及2年生存率均顯著高于T組(P<0.05)；2組患者在治療期間，各項(xiàng)不良反應(yīng)的發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同ERCC-1基因型患者化療療效及預(yù)后情況比較 n=15

2.4 HIF-1α、HIF-2α以及ERCC-1蛋白與患者貧血、化療后中位PFS和中位TTP的相關(guān)性分析 以HIF-1α、HIF-2α以及ERCC-1蛋白表達(dá)水平作為自變量分別與患者貧血、化療后中位PFS和中位TTP進(jìn)行Spearman或Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：HIF-1α、HIF-2α與患者是否存在貧血有明顯相關(guān)性(P<0.05)，而ERCC-1分型與患者的化療后中位PFS和中位TTP具有明顯相關(guān)性(P<0.05)。見表5。

3 討論

目前，醫(yī)學(xué)科研工作中，對(duì)于腫瘤的靶向治療的研究是一項(xiàng)熱門領(lǐng)域。要實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療，需要我們不斷提高對(duì)腫瘤組織在分子水平的特征的了解。實(shí)體腫瘤在其生長(zhǎng)發(fā)育的過程中，由于普遍存在低氧環(huán)境，故容易誘導(dǎo)HIF-1、HIF-2基因的表達(dá)[7]。HIF-1、HIF-2能夠通過參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、新血管生成和腫瘤干細(xì)胞分化等途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)發(fā)育的干預(yù)[8]。

表5 HIF-1α、HIF-2α以及ERCC-1蛋白與患者貧血、化療后中位PFS和中位TTP的相關(guān)性分析

HIF-1最早在低氧環(huán)境中誘導(dǎo)激活EPO轉(zhuǎn)錄而發(fā)現(xiàn)，是一種氧依賴性轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下其表達(dá)加強(qiáng)，可廣泛存在于各個(gè)組織細(xì)胞中[9]。HIF-1由α和β兩種亞基構(gòu)成，其中，HIF-1α是HIF-1所獨(dú)有的氧調(diào)節(jié)蛋白[10]。在缺氧條件下，HIF-1α的降解受阻，可與HIF-1β穩(wěn)定結(jié)合，表達(dá)水平提高[11]。另外研究表明，除缺氧外，HIF-1α表達(dá)水平的提高還可能與抑癌基因的失活、某些金屬離子、某些生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等有關(guān)[12]。目前已經(jīng)明確的HIF-1基因的靶基因有70幾種，包括離子代謝、能量代謝、兒茶酚胺代謝、腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生產(chǎn)、炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖等方面，可編碼的產(chǎn)物包括EPO、VEGF、IGF-1、ET-1、血紅素加氧酶-1等，這些物質(zhì)在腫瘤組織中，可以參與細(xì)胞代謝、血管生成、腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等多項(xiàng)活動(dòng)[13，14]。因此，HIF-1基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。HIF-2α也是腫瘤分子水平的研究熱門之一，主要探究其在腫瘤的生長(zhǎng)及預(yù)后中的作用，據(jù)報(bào)道，HIF-2α存在于多種腫瘤組織中，且相較于HIF-1α的表達(dá)更具組織特異性[15，16]。

宮頸癌的治療同樣是臨床研究的熱門領(lǐng)域，一些分子水平的檢測(cè)指標(biāo)同樣可以反映患者對(duì)治療效果的敏感度，據(jù)報(bào)道，ERCC基因表達(dá)與順鉑新輔助化療的療效有密切關(guān)系[17]。順鉑新輔助化療是目前臨床上廣泛采用的一種術(shù)前輔助化療方式，鉑類藥物主要通過與細(xì)胞DNA形成穩(wěn)定加和物，從而導(dǎo)致DNA的損傷，組織腫瘤細(xì)胞的增殖[18]。腫瘤組織對(duì)鉑類藥物的敏感性受多種因素的影響，其中，DNA損傷的耐受程度是最重要的因素之一，而核苷酸切除修復(fù)作為人類最主要的DNA修復(fù)方式，與DNA損傷的耐受程度最為相關(guān)[19]。ERCC-1基因則是參與該修復(fù)方式的最主要基因，它在識(shí)別基因受損部位后，可與其他蛋白協(xié)同切開受損DNA的5’端，從而參與核苷酸的切除修復(fù)。此外，ERCC-1基因還可以通過雙鏈斷裂、同源末端鏈接等其他途徑參與DNA的修復(fù)[20]。據(jù)報(bào)道，不同基因型的ERCC-1基因有不同的表達(dá)頻次和程度，且C/C型相較于T/T型對(duì)鉑類藥物的反應(yīng)更好[21]。還有研究報(bào)道，ERCC-1基因型為T/T型，可顯著提高多種惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[22]。

本研究結(jié)果顯示，晚期宮頸癌患者的HIF-1α和HIF-2α基因以及蛋白的表達(dá)，相較于良性病變的患者均具有特異性，證明HIF-1α和HIF-2α基因在腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，可能通過某種方式起著促癌的作用，并且，HIF-1α、HIF-2α蛋白的表達(dá)還與患者是否存在貧血具有相關(guān)性。另有研究報(bào)道，HIF-1α的表達(dá)還可能與患者是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[23]。因此，HIF-1α、HIF-2α的表達(dá)可以考慮作為臨床上宮頸癌和宮頸臉型病變的篩查指標(biāo)之一。治療方面，ERCC-1基因型為C/C型的患者接受順鉑新輔助化療的近期療效、中位進(jìn)展期、中位生存期、以及2年生存率都明顯優(yōu)于T/T型患者。說明C/C型患者的ERCC-1基因表達(dá)程度更低，DNA修復(fù)能力更弱，對(duì)順鉑新輔助化療具有更高的敏感性，在實(shí)際臨床工作中，可將ERCC-1基因分型作為選擇治療方法的重要參考因素。

綜上所述，臨床上對(duì)于疑似宮頸癌的患者，測(cè)量HIF-1α和HIF-2α基因和蛋白的表達(dá)情況，有助于協(xié)助診斷。而對(duì)于已經(jīng)確診為晚期宮頸癌，需要進(jìn)行化療的患者，測(cè)量ERCC-1基因型有助于選擇有效的化療方案，具有重要的臨床意義。