Sox2和ABCC5在乳腺癌中的表達(dá)及與化療敏感性的關(guān)系

張鵬 徐洪燕 孫勇

乳腺癌是全球女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，已成為女性健康的主要威脅。乳腺癌的治療方法主要為手術(shù)，化學(xué)療法，放射療法，分子靶向療法和內(nèi)分泌治療的組合療法[1-3]。然而，即使根據(jù)NCCN指南給予治療，20%～40%的乳腺癌患者仍然患有疾病復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能性?；煵幻舾惺侨橄侔┻M(jìn)展的最重要因素之一。多西他賽、表柔比星、環(huán)磷酰胺常聯(lián)合用于乳腺癌化療，其易導(dǎo)致化療化療不敏感引起乳腺癌的復(fù)發(fā)和進(jìn)展[4,5]。Sox2是性別決定區(qū)Y相關(guān)的高遷移率族盒(sex-determining region Y-related high-mobility group box，SOX)基因家族的成員，并且已被發(fā)現(xiàn)在各種腫瘤中充當(dāng)癌基因。研究表明Sox2在肝癌組織中上調(diào)并促進(jìn)肝癌的發(fā)展，并且原癌基因C-fos通過(guò)靶向Sox2來(lái)促進(jìn)乳肝癌的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移[6,7]。ABCC5是ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)超家族的成員，是一種ATP依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其顯著降低了化療藥物的細(xì)胞內(nèi)濃度，這被廣泛認(rèn)為是化療敏感性最常見(jiàn)的潛在基礎(chǔ)，此外ABCC5已被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中相對(duì)于原發(fā)性乳腺腫瘤過(guò)度表達(dá)。研究還表明，ABCC5高表達(dá)的患者預(yù)后較差。在細(xì)胞試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)ABCC5與培美曲塞對(duì)乳腺癌化療耐藥有顯著相關(guān)性，轉(zhuǎn)染ABCC5的乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出化療不敏感特性[8,9]。本研究擬探討Sox2和ABCC5在乳腺癌中表達(dá)及與化療敏感性的關(guān)系，為乳腺癌的早期診斷及治療提供理論臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年3月至2015年8月在我院行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的乳腺癌患者136例，符合美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)(National Compre-hensive Cancer Network，NCCN)公布的2012 版《NCCNCRC診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。手術(shù)切除標(biāo)本后行病理檢查以判定臨床病理特征。同時(shí)取距乳腺癌組織>5 cm的正常乳腺組織為癌旁組?；颊咦栽柑峁┤橄侔┘罢Ｈ橄俳M織，用作分析Sox2、ABCC5 mRNA、蛋白的表達(dá)及與與臨床病理特征的關(guān)系。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn):①患者術(shù)前未接受任何放、化療；②所有患者(或患者直系親屬)簽署知情同意書(shū)；③所有患者的預(yù)計(jì)生存期均>3 個(gè)月。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①治療期間，同步接受其他腫瘤化放療的患者；②病史及隨訪(fǎng)資料不完整。本研究經(jīng)濟(jì)南市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.3 Sox2、ABCC5 mRNA水平的測(cè)定 根據(jù)制造商的方案，使用TRIzol Reagent(Life Technologies)提取總RNA。使用ReverTra Ace-αqPCRRT試劑盒(Toyobo，Japan)定量RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(Tiangen，Beijing，China)進(jìn)行成熟miRNA的RT-PCR。 qRTPCR擴(kuò)增方案根據(jù)ABRE7500 Fast系統(tǒng)上SYBR?GreenRealtime PCR Master Mix(Toyobo，Japan)的用戶(hù)指南進(jìn)行。熔解曲線(xiàn)分析用于監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的特異性。GAPDH用作對(duì)照。Sox2引物如下：正向，5’-GGACGTTCACAACCACACTG-3’;反向，5’-TCCCACTTTGGCATTCTAGG-3’Sangon Biotech，中國(guó)上海。ABCC5引物如下：正向，5’-CCAAGAAGTGTGGTGTCCTG-3’;反向，5’-ACAAAGTCGTAGGCGTCGTT-3’(Sangon Biotech，中國(guó)上海)。 GAPDH引物如下：正向，5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3’;反向，5’-TCTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’。所有實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。分析qRT-PCR結(jié)果并表示為CT的相對(duì)miRNA或mRNA水平(循環(huán)閾值)值，然后將其轉(zhuǎn)換為倍數(shù)變化，使用閾值循環(huán)(Ct)的值確定每個(gè)靶基因的mRNA表達(dá)。在與GAPDH比較后使用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)。

1.4 免疫組織化學(xué)法測(cè)定Sox2、ABCC5的表達(dá) EnVision兩步法用于免疫組織化學(xué)法。將5 μm切片脫蠟至水，并在洗滌后用0.3%過(guò)氧化氫甲醇處理10 min。然后將切片置于微波爐中，用兔抗人Sox2(1∶80稀釋)，ABCC5(1∶80稀釋)多克隆抗體，進(jìn)行抗原修復(fù)20 min，連續(xù)加入Sox2(1∶50稀釋)和ABCC5(1∶50稀釋)單克隆抗體。所有材料均購(gòu)自Abcam(Cambridge，MA，USA)。將第一抗體置于4℃過(guò)夜，然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，每次2 min。然后用自來(lái)水洗滌切片，用蘇木精復(fù)染10 min(70%～100%)水平的醇脫水，每個(gè)水平3 min。之后，將切片置于二甲苯中5 min，最后安裝并在顯微鏡下觀(guān)察。PBS緩沖液用作陰性對(duì)照而不是第一抗體，乳腺癌陽(yáng)性樣品(北京中山金橋公司中國(guó)北京)用作陽(yáng)性對(duì)照。在半定量評(píng)估中考慮百分比和強(qiáng)度，并分別計(jì)數(shù)上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分為0(0陽(yáng)性細(xì)胞)，1(1%～25%陽(yáng)性細(xì)胞)，2(26%～50%陽(yáng)性細(xì)胞)，3(51%～75%陽(yáng)性細(xì)胞)，或4(>75%陽(yáng)性細(xì)胞)。Sox2、ABCC5免疫染色的強(qiáng)度評(píng)分為0(陰性)，1(弱)，2(中間)和3(強(qiáng))。強(qiáng)度得分(0～3)乘以百分比得分(0～4)，最終得分為0(陰性)，1～4(弱表達(dá))，5～8(中度表達(dá))和9～12 (強(qiáng)烈表達(dá))。評(píng)分為0～4的樣品被認(rèn)為是低表達(dá)，而評(píng)分為5～12的樣品被認(rèn)為是高表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析。所有組織切片的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)由三名評(píng)估員評(píng)估，平均值為最終評(píng)分。

1.5 ELISA測(cè)定Sox2、ABCC5蛋白水平 4℃下常規(guī)制作正常乳腺、乳腺癌組織勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法(Sox2、ABCC5 ELISA試劑盒購(gòu)于北京九洲天瑞科技有限公司)檢測(cè)正常乳腺組織、乳腺癌組織勻漿中Sox2、ABCC5蛋白表達(dá)量。

1.6 化療方案 化療方案為多西他賽75 mg/m2(第1天)、表柔比星100 mg/m2(第3天)、環(huán)磷酰胺500 mg/m2靜脈滴注(第7天)，7 d 為1個(gè)周期，共18個(gè)周期。

1.7 乳腺癌化療敏感性判定 進(jìn)展(PD)：有新病灶出現(xiàn)或腫瘤最大橫徑與縱徑乘積增大25%以上；穩(wěn)定(SD)：無(wú)有新病灶出現(xiàn)且腫瘤最大橫徑與縱徑乘積增大不超過(guò)25%，縮小<50%；部分緩解 (PR)：腫瘤最大橫徑與縱徑乘積縮小>50%；完全緩解(CR)：腫瘤消失。低敏感組為 SD+PD；高敏感組為 CR+PR。本文高敏感患者75例，低敏感患者61例。

1.8 隨訪(fǎng) 隨訪(fǎng)起始日期為術(shù)后第1天，隨訪(fǎng)截止日期為2018年8月31日。隨訪(fǎng)方式為電話(huà)隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)內(nèi)容為：生存質(zhì)量、病情變化、治療效果、恢復(fù)情況等。

2 結(jié)果

2.1 癌旁組、乳腺癌組中Sox2、ABCC5 mRNA水平的表達(dá) 乳腺癌組Sox2 mRNA、ABCC5 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組 (t=19.326、12.326，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 癌旁組、乳腺癌組中Sox2、ABCC5 mRNA水平的表達(dá)

2.2 Sox2、ABCC5在癌旁組、乳腺癌組中的免疫組化表達(dá)評(píng)分及陽(yáng)性率 Sox2 主要定于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或深棕黃色顆粒，ABCC5 陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒；乳腺癌組Sox2陽(yáng)性102例、ABCC5陽(yáng)性106例，乳腺癌組Sox2、ABCC5陽(yáng)性率高于癌旁組(χ2=118.708、24.901，P<0.05)；乳腺癌組Sox2、ABCC5蛋白表達(dá)評(píng)分高于癌旁組(t=15.903、24.091，P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 Sox2、ABCC5在癌旁組、乳腺癌組中的免疫組化表達(dá)評(píng)分及陽(yáng)性率 n=136,例(%)

圖1 Sox2、ABCC5在癌旁組、乳腺癌組的表達(dá);A Sox2在癌旁組中表達(dá)；B Sox2在乳腺癌組中表達(dá);C ABCC5在癌旁組中表達(dá)；D ABCC5在乳腺癌組中表達(dá)(免疫組化×200)

2.3 癌旁組、乳腺癌組中Sox2、ABCC5蛋白水平的表達(dá) 乳腺癌組Sox2、ABCC5蛋白表達(dá)水平高于癌旁組(t=113.821、88.774，P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 Sox2、ABCC5蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 Sox2、ABCC5蛋白表達(dá)與年齡相關(guān)性不明顯(χ2=0.348、2.429，P>0.05)；與腫瘤最大徑、病理學(xué)分級(jí)、TMN分期、浸潤(rùn)深度、淋巴血管間隙浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯，且腫瘤最大徑≥5 cm、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、浸潤(rùn)深度越深、有淋巴血管間隙浸潤(rùn)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，Sox2、ABCC5蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越高(χ2=21.889、17.231、32.026、24.764、49.788、13.782、23.791、15.460、19.436、20.424、17.352、15.631，P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 癌旁組、乳腺癌組中Sox2、ABCC5蛋白水平的表達(dá)

2.5 Sox2、ABCC5蛋白表達(dá)與化療敏感性的關(guān)系 Sox2、ABCC5蛋白表達(dá)與化療敏感性相關(guān)性明顯，且化療敏感性越低，Sox2、ABCC5蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越高(χ2=36.560、15.460，P<0.05)。見(jiàn)表5。

表4 Sox2、ABCC5蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

表5 Sox2、ABCC5蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.6 Sox2、ABCC5蛋白表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后分析 Sox2、ABCC5陰性組3年生存率及生存期均明顯高于Sox2、ABCC5陽(yáng)性組(χ2=35.211、37.816、Z=17.954、18.065，P<0.05)。見(jiàn)表6，圖2。

表6 Sox2、ABCC5蛋白表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后分析

圖2 Sox2、ABCC5 陽(yáng)、陰組 Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析

3 討論

Sox2表達(dá)失常已經(jīng)涉及許多嚴(yán)重的臨床疾病，包括人類(lèi)癌癥。功能獲得和功能喪失實(shí)驗(yàn)均表明Sox2在體外和體內(nèi)有助于肝癌細(xì)胞增殖和致瘤性質(zhì)，而在細(xì)胞水平，Sox2通過(guò)促進(jìn)G1至S轉(zhuǎn)變促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展[11]。Sox2是含有HMG結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)發(fā)揮其生物學(xué)活性。γ-晶狀體蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(fgf4)、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(UTF1)，N-cadherin和Oct3/4已被確定為Sox2的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)基因。在這些基因中，UTF1已經(jīng)顯示出被Sox2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)并介導(dǎo)Sox2在促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生中的作用。UTF1的蛋白質(zhì)產(chǎn)物細(xì)胞周期蛋白D1是在細(xì)胞周期的G0/G1至S轉(zhuǎn)換中起作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑之一[12]。因此，Sox2在促進(jìn)G0/G1至S轉(zhuǎn)換與UTF1在細(xì)胞中擴(kuò)增和(或)過(guò)表達(dá)的行為一致，是癌癥中最普遍的改變之一。Sox2在乳腺中的致癌活性已在遺傳修飾的小鼠模型中得到證實(shí)，其中UTF1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)展，而Sox2消融導(dǎo)致小鼠對(duì)幾種致癌基因誘導(dǎo)的癌癥具有抗性。此外，Sox2-null小鼠顯示出有缺陷的出生后乳房發(fā)育，這表明由于懷孕的性類(lèi)固醇環(huán)境對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的增殖缺乏所致[13]。本次研究結(jié)果顯示，乳腺癌組Sox2 mRNA表達(dá)水平、Sox2陽(yáng)性率、Sox2蛋白表達(dá)評(píng)分、Sox2蛋白表達(dá)水平高于癌旁組；Sox2與腫瘤最大徑、病理學(xué)分級(jí)、TMN分期、浸潤(rùn)深度、淋巴血管間隙浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯，且腫瘤最大徑≥5 cm、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、浸潤(rùn)深度越深、有淋巴血管間隙浸潤(rùn)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，Sox2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越高。這與上述討論符合，同時(shí)也提示Sox2在乳腺癌中高表達(dá)，Sox2能促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展

近期研究表明，ABCC5可能作為潛在的關(guān)鍵轉(zhuǎn)移和閹割抗性相關(guān)的致癌基因，然而，其潛在的分子機(jī)制仍不清楚[14]。眾所周知，增殖和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤相關(guān)死亡的兩個(gè)最常見(jiàn)原因。為研究ABCC5的功能，構(gòu)建了穩(wěn)定的ABCC5沉默/過(guò)表達(dá)LNCaP和PC-3細(xì)胞系，并研究了ABCC5的敲低/過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖，遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果表明ABCC5敲低可顯著抑制體外PCa細(xì)胞系的增殖，用ABCC5敲低構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后，PCa細(xì)胞變得不那么具有攻擊性和侵襲性，這表明ABCC5在PCa中起到轉(zhuǎn)移相關(guān)致癌基因的作用[15]。也提示ABCC5的沉默顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和體內(nèi)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果中，乳腺癌組ABCC5mRNA、陽(yáng)性率、蛋白表達(dá)評(píng)分、蛋白表達(dá)水平高于癌旁組；且ABCC5陽(yáng)性表達(dá)率與乳腺癌臨床病理特征相關(guān)明顯。這也提示，ABCC5在乳腺癌中高表達(dá)，ABCC5能促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Sox2、ABCC5蛋白表達(dá)與化療敏感性相關(guān)性明顯，且化療敏感性越低，Sox2、ABCC5蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越高。ABCC5作為關(guān)鍵的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子之一，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)單磷酸化的核苷類(lèi)似物，可以賦予對(duì)6-巰基嘌呤，6-硫鳥(niǎo)嘌呤和9-(2-膦酰基-甲氧基乙基)腺嘌呤的抗性[16]。此外，ABCC5也參與了抗紫外線(xiàn)藥物的耐藥性，該機(jī)制是基于ABCC5能特異性轉(zhuǎn)運(yùn)極性膦酸鹽(6-巰基嘌呤、5-氟尿嘧啶的單磷酸鹽)至細(xì)胞外，ABCC5基因表達(dá)增加是細(xì)胞對(duì)化療不敏感的基礎(chǔ)[17,18]。本次研究結(jié)果與之符合。

綜上所述，Sox2、ABCC5在乳腺癌組織的表達(dá)量高于癌旁組織，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起促進(jìn)作用；Sox2、ABCC5與化療敏感性負(fù)相關(guān)；Sox2、ABCC5陰性的患者能獲得較好的預(yù)后。