魚鱗多肽亞鐵螯合物的制備及結(jié)構(gòu)表征

覃 宇，鞠守勇,2*

(1.武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430074；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

【研究意義】湖北號稱“千湖之省”，境內(nèi)淡水資源豐富，漁業(yè)生產(chǎn)能力較為發(fā)達(dá)。草魚作為湖北省最大的普通淡水魚養(yǎng)殖品種，在加工過程中產(chǎn)生大量的魚鱗，可以作為水產(chǎn)品加工的下腳料，提取膠原蛋白、明膠、羥基磷灰石和脂肪酸等[1]。由于魚鱗中含有豐富的膠原蛋白，此方面的研究越來越受到關(guān)注。特別是魚鱗酶解物中的活性多肽，可以應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[2]，例如，多肽與不同金屬離子絡(luò)合可以作為多種金屬元素補(bǔ)充劑[3]。【前人研究進(jìn)展】目前，微量元素與多肽形成的螯合物研究以鐵元素居多，這是因?yàn)槎嚯?氨基酸)螯合鐵具有優(yōu)良的補(bǔ)鐵功效。美國、日本等已有微量元素螯合物應(yīng)用于飼料工業(yè)，取得了顯著效果[4]。另外，通過大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，相對于第一代無機(jī)鐵和第二代有機(jī)鐵，第三代氨基酸(多肽)鐵螯合物補(bǔ)鐵效果優(yōu)于同水平的硫酸亞鐵，其在動(dòng)物體內(nèi)的利用率翻倍[5]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，文獻(xiàn)關(guān)于氨基酸多肽鐵螯合物的報(bào)道主要集中在豆類多肽和蛋白多肽與鐵的螯合上，如大豆多肽螯合亞鐵[6]、鷹嘴豆蛋白肽螯合鐵[7]、米蛋白多肽螯合鐵[8]、魚和魚皮蛋白肽螯合鐵[9-10]、β淀粉多肽螯合鐵[11]、帶魚蛋白多肽螯合亞鐵[12]等，而有關(guān)魚鱗多肽亞鐵螯合物的報(bào)道卻不多見?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本實(shí)驗(yàn)以草魚魚鱗多肽和氯化亞鐵為原料，用抗氧化劑抑制亞鐵離子的氧化，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化螯合物的合成工藝，用紫外光譜、紅外光譜、電鏡掃描、元素分析等手段對螯合物的組成及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和表征，證明了魚鱗多肽亞鐵螯合物的形成，為魚鱗廢棄物的高值化利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚鱗多肽 分子量2500～1500 Dal，24.8 %； 500～1500 Dal，30.9 %；190～500 Dal，11.8 %；純度>96.0 %，錸德食品股份有限公司；混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液2.5 mmol/mL(Wako公司)；四水合氯化亞鐵、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、鹽酸羥胺、硫酸亞鐵銨、醋酸鈉、鄰菲羅啉、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉(國藥試劑有限公司)，均為分析純。

85-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；Cence湘儀L600離心機(jī) 湖南湘儀儀器有限公司；YRE-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；EL204電子天平 FE320酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；Vario EL Ⅲ型元素分析儀 德國元素分析系統(tǒng)公司；TAS-990AGF原子吸收光譜儀 北京普析通用儀器有限公司；Nexus 470型傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司；UV-1800型雙光束紫外可見分光光度計(jì) 日本島津儀器公司；D/max-2500PC型全自動(dòng)粉末X-射線衍射儀 日本株式會(huì)社理學(xué)公司；JSM-6390LV型掃描電鏡 日本電子株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚鱗多肽亞鐵螯合物的制備 將1.0 g魚鱗多肽粉末用30 mL水溶解，40 ℃攪拌得到澄清液，加入一定量抗氧化劑，用10.0 %的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH，在一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，5000 r/min離心10 min后，上清液用無水乙醇沉淀，并用適量甲醇洗滌數(shù)次。-50 ℃真空冷凍干燥48 h，得到魚鱗多肽亞鐵螯合物。

1.2.2 抗氧化劑類型的選擇 合成中為防止二價(jià)鐵的氧化，需加入抗氧化劑加以保護(hù)，使魚鱗多肽亞鐵螯合反應(yīng)順利進(jìn)行。在燒杯中加入1.0 g魚鱗多肽、1.0 g氯化亞鐵，再分別加入等量(各0.15 g)的鹽酸羥胺、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉3種抗氧化劑，調(diào)節(jié)pH至5左右，40 ℃下螯合反應(yīng)約1 h。然后將反應(yīng)液以5000 r/min離心10 min，傾出上清液，管中剩下的沉淀于烘箱中干燥后稱重，比較各沉淀質(zhì)量，對比上述3種抗氧化劑的抗氧化效果。

1.2.3 抗氧化劑用量的選擇 根據(jù)1.2.2中試驗(yàn)結(jié)果，選擇抗壞血酸為抗氧化劑，分別稱取0.025、0.050、0.100、0.150、0.200 g抗壞血酸，再在燒杯中加入1.0 g魚鱗多肽、1.0 g氯化亞鐵，調(diào)節(jié)pH至5左右，40 ℃下螯合反應(yīng)約1 h。然后將反應(yīng)液以5000 r/min離心10 min，移去上清液，將離心管中的沉淀干燥后稱重，通過比較各反應(yīng)的沉淀質(zhì)量來比較不同用量抗氧化劑的抗氧化效果。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 固定條件為溫度40 ℃、時(shí)間30 min、pH 5、魚鱗多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比1∶1。為分析各單因素對螯合率的影響，每次實(shí)驗(yàn)均改變其中一個(gè)條件，固定其它條件。各因素水平梯度分別為：pH(3、4、5、6、7)、魚鱗多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比(1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1)、反應(yīng)時(shí)間(20、30、40、50、60 min)、反應(yīng)溫度(10、20、30、40、50 ℃)。每個(gè)水平重復(fù)試驗(yàn)2次，結(jié)果取平均值。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn) 以上述單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，分別選取4個(gè)因素(pH、多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度)的各3個(gè)適宜水平(表1)，按L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化合成工藝，確定最佳螯合條件，正交實(shí)驗(yàn)因素和水平見表1。

1.2.6 亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用硫酸亞鐵銨配制濃度分別為8、16、24、32、40 μg/mL的鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，以1.5 g/L鄰菲羅啉溶液2 mL為顯色劑，依次加入1.0 mol/L乙酸鈉溶液5 mL和100 g/L鹽酸羥胺溶液各1 mL，以試劑空白為參比，測定波長為510 nm。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)以亞鐵離子濃度C (μg/mL)作橫坐標(biāo)，吸光度A作縱坐標(biāo)，回歸方程為A= 0.1258C+ 0.0443 (R=0.9995)。

1.2.7 亞鐵螯合率的計(jì)算 準(zhǔn)確稱取干燥的魚鱗多肽亞鐵螯合物粉末0.05 g左右(精確到0.0001 g)，加入約1～2 mL濃鹽酸，待樣品完全溶解后，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中。從中準(zhǔn)確移取5.00 mL于50 mL 容量瓶中，依次加入鹽酸羥胺溶液(100 g/L)1 mL，乙酸鈉溶液(1.0 mol/L)5 mL，1.5 g/L的鄰菲羅啉溶液2 mL，定容，搖勻，在510 nm處測定樣品溶液的吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算螯合物中亞鐵離子含量。

式中，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品溶液對應(yīng)的亞鐵離子含量(mg)，m為螯合物粉末質(zhì)量(kg)，v1為樣品試液移取體積(mL)，v0為樣品試液定容體積(mL)。

亞鐵離子螯合率的計(jì)算：

式中，m1表示與多肽螯合的亞鐵量(mg)；m0為反應(yīng)體系中加入的亞鐵總量(mg)。

1.2.8 魚鱗多肽和魚鱗多肽亞鐵螯合物的結(jié)構(gòu)表征 原料魚鱗多肽及其螯合物中的C、H、N采用元素分析儀測定，F(xiàn)e采用原子吸收光譜儀測定；二者的紫外光譜在190～400 nm的波段下用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。紅外光譜采用傅里葉變換紅外光譜儀在4000～400 cm-1區(qū)間內(nèi)掃描； X-射線衍射采用全自動(dòng)粉末X-射線衍射儀分析，工作參數(shù)為：電壓40 kV，電流100 mA，掃描速度：5 °/min，掃描范圍：5～90°，步進(jìn)：0.02°。電鏡圖采用電鏡掃描儀獲得，放大倍數(shù)為500倍，掃描條件：高壓15 KV，束流6.9×10-2mA，工作距離16.2 mm[6,13-15]。

1.2.9 數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)Excel 2010進(jìn)行整理，采用Origin 2017制圖，方差分析利用SPSS 19.0作統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化劑類型對螯合反應(yīng)中亞鐵離子的保護(hù)效果比較

鐵元素在人體內(nèi)的吸收主要以亞鐵形式存在，而亞鐵離子在水中穩(wěn)定性差，易被氧化為三價(jià)鐵離子，進(jìn)而生成不溶于水的鐵氫氧化物沉淀。由圖1可知，抗壞血酸做抗氧化劑時(shí)，產(chǎn)生的沉淀質(zhì)量最小。因此，抗壞血酸在3種抗氧化劑中的抗氧化效果最好。從圖2可知，當(dāng)質(zhì)量比為0.150∶1時(shí)，沉淀的生成量最小，故選擇抗壞血酸的用量為氯化亞鐵質(zhì)量的0.150倍。

2.2 魚鱗多肽亞鐵螯合物的制備工藝

2.2.1 pH對魚鱗多肽亞鐵螯合反應(yīng)的影響 從圖3可以看出，pH值增加，螯合率升高，反應(yīng)體系中亞鐵離子螯合率達(dá)到最高(70.3 %)時(shí)對應(yīng)的pH值為5，而pH值增加到6時(shí)螯合率又開始降低，為43.9 %。因?yàn)榇藭r(shí)OH-濃度增加，體系中大量的亞鐵離子以氫氧化物沉淀的形式存在，則與多肽螯合的幾率大大降低，導(dǎo)致螯合率下降。由于在金屬離子與多肽形成螯合物的反應(yīng)中，pH值是重要影響因素之一。在pH值低的酸性條件下，過多的氫離子與供電子基團(tuán)結(jié)合，導(dǎo)致螯合率下降。而pH值高的堿性環(huán)境中，過多的氫氧根離子會(huì)與金屬離子形成氫氧化物的沉淀。因此根據(jù)亞鐵離子的螯合率，可知最適合pH值為5。

圖1 抗氧化劑對沉淀生成的抑制效果

圖2 抗壞血酸與氯化亞鐵的質(zhì)量比對螯合反應(yīng)的影響

圖3 pH對螯合率的影響

2.2.2 多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比對魚鱗多肽亞鐵螯合反應(yīng)的影響 從圖4可明顯看出，螯合率的變化隨著魚鱗多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比先顯著上升，再緩慢下降，具體表現(xiàn)為在其質(zhì)量比從1∶2上升到1∶1時(shí)，螯合率由50.6 %增加到79.3 %，質(zhì)量比繼續(xù)增加，螯合率則下降為52.4 %，說明當(dāng)質(zhì)量比為1∶1時(shí)，鐵螯合率最高，所以最適合的魚鱗多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比為1∶1。

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對魚鱗多肽亞鐵螯合反應(yīng)的影響 一般來說，金屬離子與多肽的螯合反應(yīng)是快反應(yīng)，時(shí)間對反應(yīng)的影響較小。由圖5可以看出，反應(yīng)時(shí)間從20 min增加到60 min，螯合率在30 min左右達(dá)到最高，但總體變化趨勢不大。故從時(shí)間成本考慮，選擇30 min作為反應(yīng)的最佳時(shí)間。

2.2.4 反應(yīng)溫度對魚鱗多肽亞鐵螯合反應(yīng)的影響 如圖6所示，隨著反應(yīng)溫度增加，鐵螯合率先逐漸上升，再略微下降，在40 ℃時(shí)最高。說明溫度過低，會(huì)降低多肽與亞鐵離子結(jié)合的活力，而溫度過高，導(dǎo)致亞鐵離子被氧化，同樣降低螯合率。因此，選擇40 ℃作為螯合反應(yīng)的最適宜溫度。

圖4 多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比對螯合率的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對螯合率的影響

2.3 魚鱗多肽亞鐵螯合物合成工藝條件的優(yōu)化及方差分析

從表2可知，影響螯合反應(yīng)中亞鐵離子螯合率的4個(gè)因素順序依次為A、C、B、D,最優(yōu)組合為A3B2C2D2。利用SPSS19.0軟件對螯合率進(jìn)行方差分析(表3)。由表2～3可知，pH值、魚鱗多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度都會(huì)影響螯合率，且均達(dá)到差異極顯著水平(P<0.01)。由于RA>RC>RB>RD，所以pH值對螯合率影響最大。由k值可知最優(yōu)水平為A3B2C2D2，即多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比時(shí)2∶1，pH 5，反應(yīng)時(shí)間為40 min，反應(yīng)溫度為30 ℃。

在設(shè)定的因素水平內(nèi)，得出螯合率最高的優(yōu)化組為在此工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)的螯合率平均值為(83.4±0.52) %， 均高于其它正交試驗(yàn)結(jié)果。

2.4 魚鱗多肽和魚鱗多肽亞鐵螯合物的結(jié)構(gòu)表征分析結(jié)果

2.4.1 魚鱗多肽亞鐵螯合物的紫外光譜分析 從圖7可看出，兩者具有不同的最大吸收峰，魚鱗多肽溶液的最大吸光度在204.5 nm，亞鐵螯合物的最大吸光度為201.0 nm，說明由于亞鐵離子的加入導(dǎo)致了多肽分子中某些基團(tuán)結(jié)構(gòu)的變化，基團(tuán)中電子躍遷能級發(fā)生了改變，從而使螯合后的產(chǎn)物的最大吸收產(chǎn)生了藍(lán)移。據(jù)此可判定魚鱗多肽與亞鐵離子螯合后生成了新的物質(zhì)[14]。

圖6 反應(yīng)溫度對螯合率的影響

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

注：k1、k2、k3、R為鐵螯合率對應(yīng)的參數(shù)。

表3 方差分析

注：“**”表示差異極顯著(P< 0.01)。

2.4.2 魚鱗多肽和魚鱗多肽亞鐵螯合物元素分析 由表4可以看出，魚鱗多肽與氯化亞鐵螯合后含鐵量為10.625 %，N、C、H含量明顯降低，元素組成符合多肽亞鐵螯合物主要元素成分，為氨基酸和鐵元素共同組成，證明了魚鱗多肽亞鐵螯合物的生成。

2.4.3 魚鱗多肽和魚鱗多肽亞鐵螯合物紅外光譜分析 多肽分子中有一些特征官能團(tuán)，如羰基、氨基、羧基等，當(dāng)多肽分子與金屬離子配位后，這些特征基團(tuán)在紅外光譜中的特征峰會(huì)產(chǎn)生不同程度的位移[16]。從圖8可知，其中3301.42 cm-1處為-NH2的吸收峰，1654.39 cm-1處為酰胺I帶的C=O的吸收峰，1544.76 cm-1屬于酰胺II帶的-NH吸收峰，1447.88 cm-1為-COO-吸收峰，這說明多肽上的多個(gè)官能團(tuán)，如氨基、羧基、肽鍵等都參與了與亞鐵離子的螯合反應(yīng)。特征區(qū)-NH2的吸收峰移動(dòng)至3362.61 cm-1處，發(fā)生明顯的位移，說明氨基多肽分子中的氨基參與了反應(yīng)；指紋區(qū)C=O的吸收峰移動(dòng)至1651.84 cm-1處；-COO-的吸收峰移動(dòng)至1452.97 cm-1；另外，在1103.68 cm-1處吸收峰強(qiáng)度較大，與文獻(xiàn)中PtNH2峰吸收位置相似，表明亞鐵離子與多肽中的氨基發(fā)生了螯合反應(yīng)[17]。

表4 魚鱗多肽與魚鱗多肽亞鐵螯合物元素分析結(jié)果

圖8 魚鱗多肽和鐵肽螯合物的紅外光譜圖

圖9 魚鱗多肽和多肽螯合鐵的X-衍射圖譜

2.4.4 魚鱗多肽和多肽亞鐵螯合物的X光衍射光譜分析 如圖9所示，其中多肽的衍射圖譜上沒有出現(xiàn)較強(qiáng)的X衍射峰，只在2θ為20.55 °處有吸收，且吸收峰本底大，吸收峰強(qiáng)度不大，說明魚鱗多肽組成復(fù)雜，所得的多肽是無規(guī)則的非晶型結(jié)構(gòu)。魚鱗多肽加入亞鐵離子后，生成多肽亞鐵螯合物的X光衍射圖譜發(fā)生了變化。能明顯看到20.55 °處的吸收峰減弱，具有多個(gè)典型晶體的比較尖銳的衍射線。這表明多肽與亞鐵離子螯合后，產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與螯合前相比發(fā)生了一定程度的改變，由原料的無定形結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)晶結(jié)構(gòu)和無定型結(jié)構(gòu)共存的狀態(tài)，結(jié)晶度大幅提高[14,18]。

圖10 魚鱗多肽及多肽亞鐵螯合物的電鏡掃描圖(×500)

2.4.5 魚鱗多肽和多肽亞鐵螯合物的電鏡掃描[13,15]由圖10可見，魚鱗多肽在螯合前結(jié)構(gòu)疏松，表面光滑、透亮，呈圓球空心結(jié)構(gòu)，與亞鐵離子螯合后呈致密的類似于鹽的結(jié)構(gòu)，多肽分子表面覆蓋有許多白色晶粒，為小顆粒聚集體，應(yīng)該是吸附在膠原多肽上面的亞鐵晶體。由此推斷，多肽分子與亞鐵離子之間除了配位結(jié)合、離子結(jié)合之外，還有一定的吸附作用。

3 討 論

富含鐵元素的食物需在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為二價(jià)鐵后才能被人體吸收利用，因此在合成魚鱗多肽螯合鐵的過程中，為防止亞鐵離子的氧化，需加入抗氧化劑進(jìn)行保護(hù)。魚鱗作為水產(chǎn)加工的常見下腳料，通過蛋白酶水解后得到多肽，與亞鐵離子螯合后，不僅提高了生物利用度，還具有了抑菌、抗氧化、防貧血等多種生理功能[4,10,19]。由于原料價(jià)廉易得，技術(shù)路線簡單，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

通過比對魚鱗多肽和魚鱗多肽螯合亞鐵的表征圖譜，推測亞鐵離子與魚鱗多肽的結(jié)合方式多樣，如Fe2+與多肽分子中羧基與氨基的配位結(jié)合、Fe2+與羧基陰離子的離子鍵結(jié)合以及多肽分子表面對Fe2+離子的吸附作用。為進(jìn)一步弄清螯合產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，可對螯合初產(chǎn)物進(jìn)行超濾分離[19]，從而在下一步工作中繼續(xù)探討其生理活性和功能。

4 結(jié) 論

本研究以草魚魚鱗多肽和亞鐵鹽為原料，對其螯合反應(yīng)的合成條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，得到魚鱗多肽亞鐵螯合物的最優(yōu)條件為：抗壞血酸與亞鐵鹽的質(zhì)量比為0.150∶1，魚鱗多肽與亞鐵鹽的質(zhì)量比為2∶1，pH 5，螯合時(shí)間為40 min，反應(yīng)溫度為30 ℃，在此條件下測得的鐵螯合率為83.4 %。比大豆多肽亞鐵螯合物[6]的螯合率(86.6 %)略低，但稍高于帶魚蛋白螯合多肽亞鐵[12]的螯合率(80.46 %)。螯合率差異的存在可能與多種因素有關(guān)，如原料類型、由不同原料得到的多肽中氨基酸組成、分子量分布等，從而導(dǎo)致各自螯合條件不同，鐵與多肽螯合的產(chǎn)率有高有低。

紫外、紅外光譜分析以及X衍射分析和電鏡掃描對原料魚鱗多肽和其亞鐵螯合物進(jìn)行表征，說明了亞鐵離子與氨基以及羧基以共價(jià)鍵的形式結(jié)合，合成出新型的魚鱗多肽亞鐵螯合物，為魚鱗廢棄物的綜合利用提供了基礎(chǔ)，后續(xù)工作中將對該螯合產(chǎn)物生理活性開展進(jìn)一步的研究。