C3植物葉片跨膜電勢差(ΔΨ)的光譜測量

呂 輝， 王春波， 王 芬， 崔寶祿， 宋麗莎

(黔南民族師范學(xué)院 生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院， 都勻 558000)

光合作用是地球生物圈最重要的生化反應(yīng)過程之一。它能夠固定大氣中的CO2生成有機(jī)物，為人類的生存提供物質(zhì)基礎(chǔ)。C3植物是最為重要的放氧型光合生物之一，其光合作用的原初階段發(fā)生在光系統(tǒng)反應(yīng)中心，集光復(fù)合體吸收太陽光能，通過激子傳遞機(jī)制，直至被光反應(yīng)中心色素分子捕獲，用來催化光反應(yīng)中心的電荷分離。除了用于光合作用外，光能也能以葉綠素?zé)晒廨椛涞男问蕉鴵p失[1-2]。隨后，水分子在光放氧復(fù)合體中裂解，釋放出氧氣、質(zhì)子和電子。釋放的電子經(jīng)線性電子傳遞鏈傳遞至鐵氧還蛋白-NADP+-氧化還原酶(FNR)，還原NADP+并合成NADPH。同時，光合反應(yīng)的電子傳遞過程和質(zhì)子跨類囊體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)相偶聯(lián)，形成跨膜的質(zhì)子梯度。根據(jù)Mitchell的化學(xué)滲透偶聯(lián)假說[3-4]，質(zhì)子梯度和跨膜電勢差在能量上是等價的，并且共同作用形成了質(zhì)子動勢(pmf)。

(1)

其中i和o代表類囊體內(nèi)腔和外周基質(zhì)，ΔΨ和ΔpH為電勢差和pH值差，R、T和F有其通常的物理意義。

質(zhì)子動勢為ATP合成提供能量來源，最終，合成的ATP和NADPH被用于Calvin-Benson循環(huán)來固定CO2合成有機(jī)物。

跨膜電勢在光合能量轉(zhuǎn)化中扮演相當(dāng)重要的角色。它不僅是光合能量傳導(dǎo)的一個重要指針[5]，同時，研究電勢信號曲線的衰退可以得到關(guān)于類囊體膜的滲透性[6]及其跨膜離子流強(qiáng)度的信息[7]。更為重要的是，跨膜電勢差對電子傳遞鏈中電荷分離的穩(wěn)定性以及調(diào)控電荷復(fù)合具有重要作用[8-10]?？缒る妱莶畹臏y量可以使用微電極直接刺入葉綠體類囊體中[11]，或者用膜片鉗夾住葉綠體再用微電極刺入類囊體測量跨膜電壓或者電流[12-13]。但是上述這兩種方法都會對樣本產(chǎn)生刺入性損傷，造成電勢無法預(yù)估的損失。除了微電極刺入，跨膜電勢差還有一種快速、靈敏以及無損樣本的探測方式，即測量P515信號。P515信號的產(chǎn)生是因為跨膜電勢差迫使葉綠素分子，主要是胡蘿卜素以及葉綠素b對入射光的最大吸收峰遷移至515 nm。本研究以煙草葉片(Nicotianatabacum)作為待測樣品，使用Dual-PAM-100葉綠素?zé)晒鈨x的P515/535雙組件模塊，測量煙草葉片在不同光信號條件下的P515信號變化情況。實驗結(jié)果可為研究C3作物高光效品種選育提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

研究在珍珠巖基質(zhì)中種植煙草苗(Nicotianatabacum)，并施以Knop營養(yǎng)液，放置在Sanyo植物生長箱中培養(yǎng)2周，培養(yǎng)箱中模擬白晝黑夜時間設(shè)置為8 h/16 h，白晝時光強(qiáng)度為90 μmol/m2·s。白晝黑夜溫度分別設(shè)置為22 ℃/15 ℃。使用Dual-PAM-100葉綠素?zé)晒鈨x的P515/535模塊來測量P515信號。P515/535模塊包含發(fā)射單元DUAL-EP515和探測單元DUAL-DP515。DUAL-EP515 可以由一個支撐臂和DUAL-DP515串聯(lián)連接起來。P515信號是測量葉片透過光的550 nm和515 nm的差值，即ΔA550-515 nm。選擇550 nm是為了能消除“光散射”效應(yīng)所產(chǎn)生的光吸收峰的疊加，因為535 nm反映了“光散射”效應(yīng)所產(chǎn)生的光吸收峰遷移，535 nm的Gauss吸收峰在515 nm和550 nm所在的部分均勻一致，所以計算葉片透過光的550 nm和515 nm的差值，在理論上可以消除“光散射”效應(yīng)所產(chǎn)生的在515 nm吸收峰的疊加。

2 結(jié)果

圖1為煙草葉片首先受到ST的激發(fā)，5 s過后，再受到1 s的紅光照射的ΔA515-550曲線，光強(qiáng)為1024 μmol/m2·s。單周轉(zhuǎn)飽和光的激發(fā)使ΔA515-550信號迅速上升，然后以雙指數(shù)型在大約3 s內(nèi)衰減至0。通過曲線擬合，可以得到兩個指數(shù)加和形式的衰減方程為：

y=0.0068+0.4966×e-(x-2.1)/0.839 97+0.4966×e-(x-2.1)/0.687 25

(2)

單周轉(zhuǎn)飽和光(ST)的脈沖時長為5 μs，光強(qiáng)為200 000 μmol/m2·s。向上的箭頭(橘黃色)表示受到ST激發(fā)的瞬間。衰減信號中的紅色曲線是擬合曲線。圖中第一個向上箭頭(橘黃色)表示ST激發(fā)，第二個向上箭頭(紅色)表示開啟1 s時長的紅光

圖1 煙草葉片受到單周轉(zhuǎn)飽和光激發(fā)時的ΔA515-550信號

Figure 1 Time course of measured ΔA515-550 nm signal induced by ST flash

在單周轉(zhuǎn)飽和光激發(fā)的條件下，ΔA515-550信號的衰減呈現(xiàn)明顯的雙指數(shù)階段，擬合方程的第一個指數(shù)項的冪是1/0.839 97(底為e-1)要小于第二個指數(shù)項的冪1/0.687 25，因此ΔA515-550信號在第一階段以更快的速度衰減，在第二階段衰減的速度比第一階段要慢。

樣品首先用單周轉(zhuǎn)飽和光激發(fā)，5 s后，時長為1 s的可見光開啟，ΔA515-550信號可達(dá)到的最大值是受到ST激發(fā)的P515信號最大值的大約5倍。

ΔA515-550曲線在1 s可見光照射下，呈現(xiàn)明顯的雙峰特征(圖2)。在可見光開啟后，第一個峰值迅速形成；第二個峰值在大約100 ms出現(xiàn)。雙峰之間產(chǎn)生了一個低谷。曲線最終在1 s內(nèi)衰減了大約30%。這種雙峰模式符合文獻(xiàn)中記錄的1 s可見光入射的測量曲線[12-13]。

圖2 煙草葉片受到1 s時長可見光照射的ΔA515-550信號

圖3中顯示了光照60 s并在光源關(guān)閉后記錄之后的120 s煙草葉片的ΔA515-550信號，此信號特征與先前Schreiber等[14-15]測量的信號以及Johnson等[16]測量的信號完全符合。此信號的特征為：光源開啟后的ΔA515-550信號迅速達(dá)到峰值，隨后在接下來的30 s內(nèi)，信號衰減到峰值的50%左右。然后信號緩慢地提升至60 s左右達(dá)到穩(wěn)態(tài)。當(dāng)關(guān)閉光源時，ΔA515-550信號迅速下降至最低點(diǎn)，然后緩慢上升直至達(dá)到另一個穩(wěn)態(tài)。

圖3 煙草葉片受到60 s時長可見光及其之后關(guān)閉光源后 120 s的ΔA515-550信號

3 討論與結(jié)論

測量C3植物葉片的類囊體跨膜電勢可以采用微電極刺入的方法，但無論是電極直接刺入法還是改進(jìn)的膜片鉗技術(shù)，微電極法都要求葉綠體的尺寸足夠大，例如Vredenberg等[12-13]在微電極法中所使用的銀道椒草(Peperomiametallica)或角苔類(Anthoceros)的葉綠體，再者，微電極刺入膜內(nèi)所產(chǎn)生的刺口處的電流流失對于跨膜電壓測量也會產(chǎn)生不可控的損失。因此，測量電勢引起的葉綠素分子的吸收峰遷移，即測量P515信號這樣一種無損樣本，靈敏迅捷的方法，現(xiàn)已成為實驗室測量葉綠體跨膜電勢的一種常用技術(shù)手段。在圖1中，葉片受到單周轉(zhuǎn)飽和光的激發(fā)時，P515信號的快速上升反映了在光反應(yīng)中心(PSI和PSII)發(fā)生的初級電荷分離反應(yīng)以及后續(xù)在細(xì)胞色素b6/f發(fā)生的次級電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)[14-15]。隨后的電信號衰減則反映了質(zhì)子的跨膜傳導(dǎo)過程，較快的電信號衰減可能是ATP合成酶被激活而形成的質(zhì)子傳導(dǎo)所造成的[16]，而較慢的衰減則可能是藉由類囊體膜中離子通道的質(zhì)子傳導(dǎo)所造成的[17]。在圖2中，P515信號的雙峰特征并不是必然會出現(xiàn)，特別是第二個峰會因為待測量的樣本品種以及待測樣品的生理狀態(tài)不同而不同。Bulychev和Vredenberg[17]通過同時測量樣品的葉綠素?zé)晒庖约翱缒る妱莅l(fā)現(xiàn)，跨膜電勢的第二個峰值在時間上與熒光曲線的一個瞬時下降相關(guān)聯(lián)，這可能是由下列光化學(xué)反應(yīng)所造成的葉綠素?zé)晒獯銣纾嘿|(zhì)體藍(lán)素(Pc)攜帶的電子傳遞至光化學(xué)反應(yīng)中心I(PSI)，并最終傳遞至鐵氧還蛋白-NADP+-氧化還原酶(FNR)的化學(xué)反應(yīng)過程。在圖3中，關(guān)閉光源后，ΔA515-550信號急劇下降至最低點(diǎn)，隨后又緩慢地恢復(fù)上升到另一個穩(wěn)態(tài)，這個穩(wěn)態(tài)就被稱為所謂的“黑暗基線”，根據(jù)Kramer和Scaksteder[18]首創(chuàng)的“DIRK”分析，即暗黑區(qū)間弛豫分析(Dark interval relaxation kinetics)法，黑暗基線至有光時的穩(wěn)態(tài)信號線的差值反映了在光照時跨膜的電勢差(ΔΨ)的大小，而黑暗基線至關(guān)閉光源時，P515信號下降的最小值點(diǎn)的差值反映了在光照時跨膜pH值的大小。因此，對暗黑適應(yīng)后的樣品進(jìn)行P515信號的測量，不僅可以得知關(guān)于跨膜電勢的信息，也可以獲知關(guān)于跨膜化學(xué)勢的數(shù)據(jù)，因此，最終也可定量地獲得跨膜質(zhì)子動勢的大小。因此，P515光譜測定方法是一種可以測量跨膜電勢差、跨膜ΔpH以及跨膜質(zhì)子動勢差的有力武器，可為深入研究C3作物光合過程原初反應(yīng)的能量轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制提供技術(shù)支持。

本研究以煙草葉片作為實驗樣品，使用雙通道脈沖振幅可調(diào)式葉綠素?zé)晒鈨x(Dual-PAM-100)，并搭配最新設(shè)計的P515/535雙組件模塊，得出樣本在單周轉(zhuǎn)飽和光、1 s可見光及60 s可見光的P515光譜變化結(jié)果，并詳細(xì)分析其形成原因。結(jié)果顯示，P515光譜測定法是一種可以測量跨膜電勢差、跨膜ΔpH以及跨膜質(zhì)子動勢差的靈敏迅捷、無損樣本的探測技術(shù)，可為今后農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的C3作物高光效品種的選育提供技術(shù)支持。