騰沖馬同期發(fā)情和定時輸精技術(shù)研究

崔代永，張志勇，劉 青，李 楠，吳帥帥，孫 偉，曾申明,*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京100193）

馬屬動物的發(fā)情規(guī)律與其他家畜明顯不同，主要表現(xiàn)為發(fā)情時間長、排卵時間不固定。為提高配種率，在輸精或配種前需要反復(fù)檢查卵泡的發(fā)育狀態(tài)，增加工作量的同時也影響了配種效率。隨著新型馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，母馬同期發(fā)情和定時輸精技術(shù)的研究勢在必行。根據(jù)母馬發(fā)情周期的內(nèi)分泌特點(diǎn)，母馬群藥物處理后可以集中發(fā)情和排卵，進(jìn)而能實(shí)施集中輸精。處于正常發(fā)情期的母馬通過外源孕激素處理可以抑制卵泡發(fā)育，然后注射前列腺素，溶解卵巢上的黃體組織，當(dāng)外源孕激素水平快速下降后，卵泡開始發(fā)育，大多數(shù)母馬在孕激素水平下降后的7～10d 排卵，輸精后的情期受胎率能達(dá)到60%以上[1]。通常，在馬屬動物中，飼喂烯丙孕素和注射緩釋黃體酮是外源孕激素處理的主要方法，但這兩種用藥方式很難快速終止外源激素作用，因此同期發(fā)情的效率較低[2]。孕激素陰道栓是一種簡單、安全和廉價的激素調(diào)節(jié)方法，可以確保母馬處理期間血液中孕激素含量維持穩(wěn)定，且在撤栓后迅速終止外源激素的供給，解除其對卵泡發(fā)育的抑制，保證母馬群卵泡發(fā)育的同步性。

在母馬繁殖技術(shù)調(diào)控方面，多種藥物組合，如孕酮（P4）和雌二醇（E2）配合人絨毛膜促性腺激素（hCG）和促性腺激素釋放激素（GnRH）類似物已經(jīng)用于同期發(fā)情和排卵控制，并且取得了很好的效果[3-5]。前列腺素（PG）及其類似物單獨(dú)或者結(jié)合hCG、GnRH 已被證明可以使母馬同期發(fā)情[6-7]。何良軍等[8]利用PGF2α（前列腺素F2α）誘導(dǎo)9 匹發(fā)情正常的母馬同期發(fā)情，5 d 后母馬都出現(xiàn)了發(fā)情并排卵。目前hCG 和GnRH 類似物已經(jīng)廣泛用于母馬的誘導(dǎo)排卵和定時輸精。當(dāng)母馬卵泡直徑達(dá)到35 mm 時肌肉注射hCG，80%在48h 內(nèi)排卵[9]。Awan 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，卵泡直徑達(dá)到35 mm 的母馬間隔12 h 進(jìn)行2 次肌肉注射GnRH 類似物，24 h 后卵泡直徑顯著大于對照組，48 h 內(nèi)的排卵率顯著高于對照組，發(fā)情持續(xù)期以及排卵間隔明顯縮短。

騰沖馬具有體力、持久力和適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是我國優(yōu)秀的馱、乘、挽用地方馬品種[11]。近幾年，隨著騰沖馬經(jīng)濟(jì)價值的進(jìn)一步挖掘，規(guī)?；B(yǎng)殖逐漸成為重要趨勢。本實(shí)驗(yàn)用騰沖馬為研究對象，探索馬的同期發(fā)情和定時排卵技術(shù)，以提高優(yōu)秀母馬的繁殖效率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)選取體重 130～160 kg 的 4～6 歲的健康成年騰沖空懷母馬43 頭分成A、B 組，其中A 組23 頭為實(shí)驗(yàn)組，其中第1 胎次6 頭、第2 胎次10 頭、第3胎次7 頭，進(jìn)行同期發(fā)情處理；B 組20 頭為對照組，均為第2 胎次，不做任何激素處理。實(shí)驗(yàn)?zāi)格R采用標(biāo)準(zhǔn)圈舍飼養(yǎng)，可自由飲水和采食干草，并補(bǔ)充含玉米和豆粕的精料，每頭每天飼喂1kg。實(shí)驗(yàn)于2018 年7—8 月在遼寧省遼陽市（東經(jīng)123°，北緯41°）開展。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 前列腺素類似物：氯前列醇鈉（PG）由寧波第二激素廠生產(chǎn)，規(guī)格2 mL，含量0.2 mg（ 批 號：180611）。GnRH 類 似 物：1.0 mg/mL， 由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。孕激素陰道緩釋栓由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。陰道沖洗液配制：500 mL 生理鹽水加入硫酸慶大霉素0.4 g（成都新亨藥業(yè)有限公司，批號：20170526）和青霉素鈉4.8 g（成都新亨藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：201711115）。新潔爾滅消毒液配制：新潔爾滅（山東安捷高科消毒科技有限公司，批號：2018020225）與生理鹽水按1:4 配制。超聲波檢查儀購自徐州凱信電子設(shè)備有限公司，KX5600。

1.3 精液采集、運(yùn)輸和保存 公馬精液采集后加入等體積預(yù)熱的低溫保鮮精稀釋液，1 500 r/min 離心10 min 棄去上清液，然后再加入適量低溫保鮮稀釋液（每10 mL中精液中的總精子數(shù)為10 億，精子活力在75%以上），放在4℃恒溫保存待用。

1.4 同期發(fā)情和定時排卵程序與方法 在母馬發(fā)情周期內(nèi)的任意一天，對A 組母馬肌肉注射GnRH 類似物1.0 mL，并記為第0 天。在第2 天母馬群外陰部用新潔爾滅消毒液清洗后，在陰道穹窿放置無菌孕酮緩釋陰道栓。在第8 天，母馬肌肉注射4 mL 氯前列醇鈉；第11 天再次肌注4 mL 氯前列醇鈉，同時取出陰道栓。取栓后，每匹母馬使用100 mL 沖洗液對陰道進(jìn)行沖洗。同時，B 組在第0、8 和11 天各注射1、4、4 mL 生理鹽水。從第12 天開始對A 組和B 組的卵泡生長發(fā)育情況進(jìn)行超聲波檢測，直至排卵。當(dāng)A 組母馬卵巢上存在直徑大于33 mm 的卵泡時，頸部肌注GnRH 類似物1 mL。在藥物注射后8～12 h，向母馬子宮體輸入10 mL 低溫保鮮精，總精子數(shù)為10 億，輸精前精子直線前進(jìn)運(yùn)動率為50%以上，在藥物注射后24 h 和48 h 采用B 超檢查排卵狀態(tài)。當(dāng)B 組母馬卵巢上出現(xiàn)直徑大于33mm 的卵泡時，頸部肌注生理鹽水1 mL，8～12 h 后與A 組進(jìn)行相同的人工授精和B 超檢測處理，48 h 后不排卵，再進(jìn)行一次人工授精。配種后15 d 使用B 超檢查母馬妊娠情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 用 Excel 統(tǒng)計(jì)第 12～16 天內(nèi)的發(fā)情率、第2 次GnRH 類似物注射后24 和48 h 內(nèi)的排卵率、配種后15 d 的受胎率。采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件，用卡方檢驗(yàn)法對不同胎次母馬的發(fā)情同步率和受胎率進(jìn)行顯著性分析。P＜0.05 為差異顯著。本試驗(yàn)中，當(dāng)母馬最大卵泡直徑達(dá)到33 mm 時，確定為發(fā)情。

2 結(jié) 果

2.1 母馬在同期發(fā)情處理后第12～16 天發(fā)情率 如表1所示，A 組母馬在同期發(fā)情處理后第12～16 天有86.95%的母馬卵巢上出現(xiàn)直徑大于33 mm 卵泡，集中發(fā)情效果明顯，B 組在第12～16 天卵巢上卵泡達(dá)到33 mm 的比例為20.00%。

2.2 不同胎次母馬的同情發(fā)情率和受胎率 如表2 所示，A 組前3 胎次之間的發(fā)情同步率和受胎率差異不顯著；A組和B組之間的發(fā)情同步率差異顯著，受胎率差異不顯著。

表1 母馬在第12～16 天內(nèi)卵泡達(dá)到33mm 的比例 %

表2 不同胎次母馬處理后的發(fā)情率和受胎率 %

2.3 GnRH 類似物和生理鹽水處理對母馬排卵時間的影響 如表3 所示，當(dāng)母馬卵巢存在直徑大于33 mm 卵泡時，A 組肌注1 mL GnRH 類似物、B 組注射1 mL 生理鹽水，A 組母馬24 h 內(nèi)的排卵率為15%，而24～48 h排卵率為85%，B 組母馬24～48 h 內(nèi)排卵率為25.00%，大于48 h 排卵率75.00%。

表3 母馬注射GnRH 類似物后的排卵時間分布 %

3 討 論

母馬發(fā)情周期一般由2～3 個卵泡波構(gòu)成，每個卵泡波啟動10～15 個卵泡發(fā)育，最終1～2 個卵泡發(fā)育為優(yōu)勢卵泡并排卵，其他卵泡閉鎖[12]。在黃體期，初級卵泡波和次級卵泡波的變化由外周促性腺激素和局部活性因子調(diào)控[13]。在此期間，外源孕激素通過抑制成熟前卵泡的生長而延長發(fā)情周期，依此可以調(diào)整母馬群卵泡發(fā)育的同步性[14]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)騰沖母馬卵泡發(fā)育動力學(xué)特性，對卵泡直徑達(dá)到33 mm 以上的母馬肌肉注射GnRH 類似物1 mL，使其2 d 內(nèi)排卵，結(jié)合黃體對外源前列腺素敏感特性[15]，先使用GnRH 處理使成熟卵泡發(fā)生排卵，2 d 后埋植陰道栓以提供血液中孕激素水平，并在第8、11 天2 次肌肉注射氯前列醇鈉以溶解內(nèi)源性黃體，阻止內(nèi)源孕激素的分泌。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，母馬群5d 內(nèi)發(fā)情率達(dá)86.95%，其中第16 天的發(fā)情率最高，第13 天最低。當(dāng)母馬卵泡直徑達(dá)到33 mm 以上時注射GnRH 類似物，48 h 內(nèi)的排卵率達(dá)100%，一次配種后的受胎率達(dá)到65%，并且對前3 胎次的母馬沒有顯著影響，實(shí)驗(yàn)效果非常明顯。

與牛羊不同，目前母馬的同期發(fā)情方案不能實(shí)現(xiàn)群體精確的排卵控制，雖然有的技術(shù)流程同步率較為集中，但是這些處理只是減少了排卵在群體內(nèi)的隨機(jī)發(fā)生，而不能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的排卵預(yù)測。這可能與馬屬動物特殊的卵泡發(fā)育規(guī)律有關(guān)，因?yàn)轳R屬動物卵泡優(yōu)勢化至排卵的時間在5～7 d，而反芻動物在1～2 d 內(nèi)完成。另外，母馬在配種季節(jié)初期用短期的外源孕激素處理后，同期發(fā)情結(jié)果不理想[16-17]。當(dāng)前關(guān)于馬屬動物不同胎次對同期發(fā)情的影響未見有相關(guān)報道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同胎次的母馬對激素的敏感性有很大差異，有可能青年母馬對激素的敏感性較差導(dǎo)致；而隨著胎次的增加受胎率低的主要原因很可能是經(jīng)產(chǎn)母馬存在一些輕微的生殖道感染。由于本次實(shí)驗(yàn)樣本量較少，下一步需擴(kuò)大樣本量繼續(xù)探討不同胎次母馬的同期發(fā)情率和受胎率。因此基于孕激素和前列腺素的同期發(fā)情方案在馬屬動物中還需進(jìn)一步研究和完善。本研究發(fā)現(xiàn)，取栓時有少量母馬出現(xiàn)陰道炎癥反應(yīng)，但使用沖洗液對陰道沖洗后，受孕率未受明顯影響。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)用孕激素陰道栓、GnRH 和前列腺素類似物處理母馬獲得了86%以上的同期發(fā)情率，發(fā)情母馬48h內(nèi)的排卵率可達(dá)100%，一次輸精的受胎率達(dá)65%。