多壁碳納米管和重金屬鎘的細(xì)菌毒性及影響機(jī)制

付 勇，裴建川，李 梅，王鵬程，王潔潔

（浙江農(nóng)林大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 杭州 311300）

隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，碳納米管在材料、催化、光學(xué)器件、分子開(kāi)關(guān)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境修復(fù)等各領(lǐng)域都有了廣泛的研究和應(yīng)用[1]，同時(shí)碳納米管對(duì)人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境的潛在風(fēng)險(xiǎn)也引起了世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注[2-6]。進(jìn)入環(huán)境中的碳納米管將不可避免地與其他化學(xué)物質(zhì)共存，碳納米管對(duì)共存污染物毒性的影響及復(fù)合毒性也越來(lái)越多地受到了研究者的關(guān)注。碳納米管可以通過(guò)吸附共存污染物，降低或增強(qiáng)共存污染物對(duì)生物的毒性。如劉信勇等[7]發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)用多壁碳納米管本身對(duì)斑馬魚(yú)Danio rerio沒(méi)有毒性，但卻由于吸附了鉛（Pb）和鋅（Zn），導(dǎo)致重金屬在斑馬魚(yú)體內(nèi)的積累，毒性劇增。YU等[8]發(fā)現(xiàn)表面未處理的單壁和多壁碳納米管抑制了大型蚤Daphnia magna對(duì)重金屬的吸收，但由于單壁和多壁碳納米管表面富有含氧官能團(tuán)，能吸附大量重金屬，因此大型蚤內(nèi)重金屬積累增強(qiáng)。WANG等[9]發(fā)現(xiàn)銅（Cu）和鉻（Cr）增強(qiáng)了碳納米管對(duì)微生物種群的影響，以羧基化和羥基化碳納米管毒性更強(qiáng)。碳納米管與重金屬的復(fù)合毒性是協(xié)同、疊加還是拮抗，不僅取決于碳納米管和重金屬的相互作用，還取決兩者與生物體的相互作用。具有不同表面官能團(tuán)的多壁碳納米管性質(zhì)差異較大，影響其與重金屬和生物體的相互作用，從而影響復(fù)合毒性；開(kāi)展不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)重金屬的吸附及生物效應(yīng)的研究十分必要。細(xì)菌是單細(xì)胞原核微生物，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，與其他生物相比，對(duì)污染物的毒性更敏感。大腸埃希菌Escherichia coli在自然界中普遍存在，常被用作毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ臀⑸?；重金屬鎘（Cd）毒性較大，在污染水體中常見(jiàn)。因此，本研究以大腸埃希菌為模型細(xì)菌，研究3種多壁碳納米管（短、短羥基和短羧基多壁碳納米管）和Cd的復(fù)合細(xì)菌毒性，從多壁碳納米管、重金屬、細(xì)菌相互作用的角度闡述了復(fù)合毒性機(jī)制，試圖為水體中多壁碳納米管和重金屬的復(fù)合毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

短多壁碳納米管（無(wú)基團(tuán)、羧基和羥基）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。具體參數(shù)為：純度＞95%，內(nèi)徑為5.0～10.0 nm，外徑為8.0～15.0 nm，長(zhǎng)度為0.5～2.0 μm。稱(chēng)量相應(yīng)的多壁碳納米管顆粒，用超純水進(jìn)行配制，使用前超聲20 min。稱(chēng)取 0.274 4 g Cd（NO3）2·4H2O，用超純水溶解并定容至1 000 mL，配制成100 mg·L-1的Cd2+儲(chǔ)備液。所用化學(xué)物質(zhì)均購(gòu)買(mǎi)自上海國(guó)藥集團(tuán)。

實(shí)驗(yàn)室大腸埃希菌（登錄號(hào):MG388227）為從生活污水中篩選分離得到[10]。菌種接種于LB固體平板，保存于4℃冰箱中。使用前接種于LB液體培養(yǎng)基（pH 7.0）培養(yǎng)過(guò)夜，為避免生理鹽水中鹽度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，細(xì)菌懸液用超純水洗滌2次后懸浮于超純水中，調(diào)節(jié)吸光度D（600）至1.0備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毒性實(shí)驗(yàn) 調(diào)節(jié)多壁碳納米管至0、20、50、100、200 mg·L-1，調(diào)節(jié)Cd2+至0、1、2、4、8、10 mg·L-1，分別測(cè)定對(duì)大腸埃希菌的單獨(dú)毒性，作為混合物細(xì)菌毒性的對(duì)照組；并比較該復(fù)合細(xì)菌毒性（即聯(lián)合或混合毒性）和疊加毒性（單獨(dú)毒性的疊加），判斷復(fù)合細(xì)菌毒性性質(zhì)（加和、協(xié)同或拮抗）。為進(jìn)一步明確多壁碳納米管對(duì)低濃度Cd2+細(xì)菌毒性的影響，固定Cd2+質(zhì)量濃度（1 mg·L-1），由于多壁碳納米管質(zhì)量濃度過(guò)高，團(tuán)聚現(xiàn)象嚴(yán)重，質(zhì)量濃度過(guò)低則與重金屬相互作用不明顯，因此固定多壁碳納米管質(zhì)量濃度為 100 mg·L-1， 與不同質(zhì)量濃度（0、 1、 2、 4、 8、 10 mg·L-1）Cd2+混合， 測(cè)定多壁碳納米管-Cd2+混合物的細(xì)菌毒性； 固定 Cd2+質(zhì)量濃度（1 mg·L-1）， 與不同質(zhì)量濃度（10、 20、 50、 100、 200 mg·L-1）多壁碳納米管混合，測(cè)定Cd2+-多壁碳納米管混合物的細(xì)菌毒性。毒性實(shí)驗(yàn)分為3 h毒性暴露實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)，均在恒溫?fù)u床中進(jìn)行，具體方法參照文獻(xiàn)[10]。細(xì)菌存活率（SB）按以下公式計(jì)算：SB=（Dst-Dso）/（Dct-Dco）×100%。其中，Dst和Dso分別代表樣品在t時(shí)刻和初始時(shí)刻的吸光度，Dct和Dco分別代表相應(yīng)對(duì)照組在t時(shí)刻和初始時(shí)刻的吸光度。根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)對(duì)照組遲滯期長(zhǎng)短，本研究t取2或3 h（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期）。

1.2.2 多壁碳納米管zeta電位測(cè)定 多壁碳納米管的團(tuán)聚狀態(tài)與大腸埃希菌的相互作用均與多壁碳納米管的表面電荷有關(guān)。不同暴露介質(zhì)中多壁碳納米管的zeta電位用納米粒度電位儀（Nano-ZS90，馬爾文公司，英國(guó)）測(cè)定。為能較準(zhǔn)確測(cè)量zeta電位，選擇多壁碳納米管質(zhì)量濃度為100 mg·L-1，Cd2+質(zhì)量濃度為10 mg·L-1。

1.2.3 沉降實(shí)驗(yàn) 多壁碳納米管的懸浮穩(wěn)定性可通過(guò)沉降實(shí)驗(yàn)表征，與細(xì)菌接觸的程度也可通過(guò)細(xì)菌懸液的沉降特征間接得出。沉降實(shí)驗(yàn)振蕩條件與1.2.1相同。其中待測(cè)多壁碳納米管質(zhì)量濃度為100 mg·L-1，Cd2+質(zhì)量濃度為10 mg·L-1。不同時(shí)間測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處多壁碳納米管懸液吸光度（D），隔30 min測(cè)定1次，共6次。共沉降率（%）用D/Do表示，其中Do表示初始吸光度。

1.2.4 吸附實(shí)驗(yàn) 碳納米管對(duì)重金屬具吸附作用。分別量取1 g·L-1的3種多壁碳納米管與不同質(zhì)量濃度（1、 2、 4、 8、 10 mg·L-1）Cd2+混合， 配置混合溶液 10 mL， 于（25±1） ℃、 150 r·min-1的恒溫?fù)u床中吸附3 h；待吸附平衡后，將樣品轉(zhuǎn)移至4 000 r·min-1下離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾；用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（Prodigy7，利曼-徠伯斯公司，美國(guó)）測(cè)定濾液中溶解Cd2+的質(zhì)量濃度。計(jì)算平衡吸附量 Qe（mg·g-1）=被吸附的 Cd2+的質(zhì)量（mg）/多壁碳納米管的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同多壁碳納米管對(duì)大腸埃希菌的毒性效應(yīng)

如圖1所示：隨多壁碳納米管質(zhì)量濃度升高，大腸埃希菌存活率下降，即多壁碳納米管的細(xì)菌毒性增強(qiáng)。毒性從強(qiáng)到弱依次為短多壁碳納米管、短羧基多壁碳納米管、短羥基多壁碳納米管。當(dāng)多壁碳納米管質(zhì)量濃度達(dá)200 mg·L-1時(shí)，大腸埃希菌存活率分別降至70%、80%和90%。

圖1 不同多壁碳納米管對(duì)大腸埃希菌的毒性Figure 1 Toxicity of different MWCNTs toward E.coli

2.2 多壁碳納米管及其Cd2+混合物的細(xì)菌毒性

由圖2A可知：Cd2+的細(xì)菌毒性（對(duì)照）隨著質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度達(dá)10 mg·L-1時(shí)，大腸埃希菌的存活率為45%。100 mg·L-1的多壁碳納米管與不同質(zhì)量濃度Cd2+混合，大腸埃希菌的存活率隨Cd2+質(zhì)量濃度增加而降低；3種多壁碳納米管-Cd2+混合物的復(fù)合細(xì)菌毒性從強(qiáng)到弱依次為短多壁碳納米管-Cd2+、短羧基多壁碳納米管-Cd2+、短羥基多壁碳納米管-Cd2+。就短羧基多壁碳納米管而言，當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度低于4 mg·L-1時(shí)，混合物的細(xì)菌毒性與Cd2+的單獨(dú)毒性幾乎一樣；隨Cd2+質(zhì)量濃度升高，復(fù)合細(xì)菌毒性明顯低于Cd2+的細(xì)菌毒性。而短羥基多壁碳納米管-Cd2+的復(fù)合細(xì)菌毒性明顯低于Cd2+的細(xì)菌毒性。比較多壁碳納米管-Cd2+的復(fù)合細(xì)菌毒性和疊加毒性可知：復(fù)合細(xì)菌毒性小于兩者疊加毒性，即復(fù)合細(xì)菌毒性是拮抗效應(yīng)（圖2A）。實(shí)際水體環(huán)境中，Cd2+質(zhì)量濃度可能較小，為了進(jìn)一步明確多壁碳納米管吸附低質(zhì)量濃度Cd2+后的細(xì)菌毒性，固定Cd2+質(zhì)量濃度至1 mg·L-1。從圖2B可以看出：隨多壁碳納米管質(zhì)量濃度上升，Cd2+-多壁碳納米管混合物細(xì)菌毒性逐漸減弱的，短多壁碳納米管-Cd2+、短羧基多壁碳納米管-Cd2+和短羥基多壁碳納米管-Cd2+的細(xì)菌存活率分別從50%、55%和60%變化為70%、80%和85%。相同條件下，復(fù)合細(xì)菌毒性由大到小依次為短多壁碳納米管-Cd2+、短羧基多壁碳納米管-Cd2+、短羥基多壁碳納米管-Cd2+。多壁碳納米管本身細(xì)菌毒性較弱，因此認(rèn)為多壁碳納米管吸附低質(zhì)量濃度Cd2+能明顯降低細(xì)菌毒性。

圖2 多壁碳納米管吸附Cd2+后混合物細(xì)菌毒性變化Figure 2 Toxicity variation of MWCNTs-Cd2+toward E.coli

2.3 多壁碳納米管及其Cd2+混合物的zeta電位

從表1可以看出：3種多壁碳納米管的zeta電位相差不多，在超純水中均帶負(fù)電荷；而加入Cd2+后，3種多壁碳納米管的負(fù)電荷部分被中和，以短多壁碳納米管表面的負(fù)電荷降低最多。

表1 多壁碳納米管顆粒及多壁碳納米管吸附Cd2+后混合物的zeta電位Table 1 Zeta potentials of MWCNTs and its compounds

2.4 多壁碳納米管及其Cd2+混合物與大腸埃希菌的共沉降

如圖3A所示：多壁碳納米管在前30 min沉降速度較快，1 h后沉降基本穩(wěn)定，懸浮濃度基本保持不變。相比之下，短多壁碳納米管穩(wěn)定性最差，3 h沉降率約90%，短羥基和短羧基多壁碳納米管穩(wěn)定性較好，3 h沉降率分別達(dá)45%和20%。吸附Cd2+后，短羧基多壁碳納米管-Cd2+混合物的3 h沉降率達(dá)50%，略高于短羧基多壁碳納米管。短羧基多壁碳納米管-Cd2+和短羥基多壁碳納米管-Cd2+的沉降率與納米管溶液沉降率幾乎一樣。大腸埃希菌懸液本身不沉降，當(dāng)在大腸埃希菌懸液中混入多壁碳納米管及其吸附混合物后（圖3B），混合懸液前30 min共沉降速度較快，1 h后沉降基本穩(wěn)定。3種多壁碳納米管與大腸埃希菌3 h共沉降率分別約40%（短多壁碳納米管）、45%（短羥基多壁碳納米管）和20%（短羧基多壁碳納米管）；3種吸附Cd2+的多壁碳納米管與大腸埃希菌3 h共沉降率分別約45%（短多壁碳納米管）、60%（短羥基多壁碳納米管）和40%（短羧基多壁碳納米管）。

圖3 多壁碳納米管及其Cd2+混合物與大腸埃希菌共沉降Figure 3 Settling properties of MWCNTs and its compounds toward E.coli

2.5 多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附實(shí)驗(yàn)

如圖4所示：當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度低于4 mg·L-1時(shí)，短多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附量隨著Cd2+的質(zhì)量濃度增加而增多。當(dāng)Cd2+的質(zhì)量濃度大于4 mg·L-1時(shí)，吸附量幾乎不變。短羧基和短羥基多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附量隨著Cd2+的質(zhì)量濃度增加而增多。相同條件下，3種多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附量從大到小依次為短羧基多壁碳納米管、短羥基多壁碳納米管、短多壁碳納米管。

3 討論

3.1 多壁碳納米管細(xì)菌毒性的影響機(jī)制

多壁碳納米管對(duì)大腸埃希菌的毒性主要來(lái)自2個(gè)方面，一是多壁碳納米管與細(xì)菌直接接觸，可能造成刺穿等物理?yè)p傷，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡；二是多壁碳納米管產(chǎn)生的活性氧自由基對(duì)細(xì)菌有氧化損傷[11-13]。本研究在黑暗條件下進(jìn)行，因此排除了活性氧自由基對(duì)大腸埃希菌的損傷，多壁碳納米管對(duì)大腸埃希菌的細(xì)菌毒性主要為直接接觸；受兩者表面電荷影響，多壁碳納米管顆粒與細(xì)菌接觸碰撞，可能造成細(xì)菌損傷。從zeta電位測(cè)定結(jié)果可知：多壁碳納米管與大腸埃希菌之間存在靜電斥力，直接接觸能力較弱；短羧基多壁碳納米管和短羥基多壁碳納米管與細(xì)菌的共沉降率與顆粒單獨(dú)沉降率幾乎一樣，說(shuō)明此2種多壁碳納米管與大腸埃希菌接觸較少，細(xì)菌毒性因而較小。相比之下，短多壁碳納米管與大腸埃希菌的共沉降率最高（60%），說(shuō)明與細(xì)菌接觸的程度最高，因而細(xì)菌毒性也最強(qiáng)。

圖4 多壁碳納米管對(duì)于Cd2+的吸附Figure 4 Adsorption of MWCNTs to Cd2+

3.2 不同多壁碳納米管及其Cd2+混合物細(xì)菌毒性的影響機(jī)制

本研究發(fā)現(xiàn)：不同官能團(tuán)多壁碳納米管吸附Cd2+的狀況不同。受溶液pH值[14]、多壁碳納米管的比表面積、表面基團(tuán)和表面電荷等影響[15-16]，多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附性能不同，吸附方式主要有物理吸附、靜電作用、離子交換和表面絡(luò)合，一般以離子交換和表面絡(luò)合為主[17]。相同吸附實(shí)驗(yàn)條件下，3種多壁碳納米管管徑和長(zhǎng)度一致，對(duì)于Cd2+的物理吸附相差不大；吸附性能主要由表面基團(tuán)決定。羧基和羥基中的氫離子（H+）均可與Cd2+發(fā)生離子交換，與羥基相比，羧基與Cd2+的化學(xué)鍵能更強(qiáng)，因此短羧基碳納米管吸附Cd2+性能優(yōu)于短羥基多壁碳納米管[18]及短多壁碳納米管。溶液中被吸附的Cd2+量越大，毒性越弱。因此使得相同條件下，多壁碳納米管及其Cd2+混合物的細(xì)菌毒性從高到低為短羧基多壁碳納米管、短羥基多壁碳納米管、短多壁碳納米管。由溶液與細(xì)菌的共沉降結(jié)果可知：Cd2+可能影響了多壁碳納米管和細(xì)菌的共沉降，原因可能是Cd2+降低了短羧基多壁碳納米管和短羥基多壁碳納米管的分散性，減少了兩者與細(xì)菌的接觸機(jī)會(huì)，Cd2+與此2種多壁碳納米管混合物和細(xì)菌的共沉降率減小，而Cd2+與短多壁碳納米管的細(xì)菌共沉降率略微增大，可能與zeta電位值有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)：Cd2+降低了多壁碳納米管表面的負(fù)電荷，Cd2+存在條件下多壁碳納米管與大腸埃希菌之間的靜電斥力降低，即多壁碳納米管與大腸埃希菌直接接觸機(jī)會(huì)增加，從而使得細(xì)菌毒性增強(qiáng)。

4 結(jié)論

相同條件下，3種多壁碳納米管的細(xì)菌毒性從強(qiáng)到弱依次為短多壁碳納米管、短羧基多壁碳納米管、短羥基多壁碳納米管。多壁碳納米管和Cd2+混合后，納米管表面負(fù)電荷被降低，與細(xì)菌間靜電斥力降低，直接接觸毒性增強(qiáng)；同時(shí)Cd2+被納米管吸附，自身毒性降低。3種多壁碳納米管與Cd2+混合物的細(xì)菌毒性均低于納米管和重金屬的毒性，其中短羥基多壁碳納米管-Cd2+混合物的細(xì)菌毒性最低，其次為短羧基多壁碳納米管。短多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附能力最弱，因此短多壁碳納米管-Cd2+的細(xì)菌毒性要高于其他2種混合物。