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    表達中國小麥花葉病毒(CWMV)外殼蛋白基因增強煙草對CWMV的抗病性

    2020-04-22 05:42:20戴良英陳劍平
    關(guān)鍵詞:花葉病毒株系抗病性

    楊 錦,靳 鵬,劉 芃,羊 健,王 洋,戴良英,陳劍平

    (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院,湖南 長沙410000;2.寧波大學(xué) 植物病毒研究所,浙江 寧波315000;3.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室,浙江 杭州311300)

    中國小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是引起小麥Triticum aestivum黃花葉病的重要病原體,嚴(yán)重威脅小麥的生產(chǎn)安全[1]。CWMV病毒直徑約為20 nm,長度為80~360 nm[2],包含2條正義RNA(ssRNA)鏈,根據(jù)大小分別命名為RNA1和RNA2。CWMV-RNA1全長7 147 nt,編碼甲基轉(zhuǎn)移酶、 RNA聚合酶蛋白(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)和運動蛋白(movement protein,MP)等3個完整蛋白質(zhì),分子量分別是153、212和37 kDa[3]。CWMV-RNA2全長3 563 nt,編碼病毒外殼蛋白(coat protein,CP)、N-CP蛋白(cystein rich protein,CRP)、CP-RT蛋白和1個富含半胱氨酸蛋白等4個蛋白質(zhì),分子量分別是19、25、84及18~19 kDa。CWMV以根部專性寄生的禾谷多黏菌Polymyxa graminis為介體傳播[4-5]。當(dāng)帶毒的禾谷多黏菌侵染植株后,病毒會在寄主體內(nèi)不斷復(fù)制使植株發(fā)病;未帶毒的禾谷多黏菌通過侵染帶毒植株后獲得病毒,成為新的病源侵染其他植株[6],且常與小麥黃花葉病毒(wheat yellow mosaic virus,WYMV)復(fù)合侵染[7];由于禾谷多黏菌的休眠孢子具有極強的抗逆性,小麥黃花葉病毒病的防治難度大大增加[6],患病小麥出現(xiàn)花葉、黃化、分蘗增生等癥狀[2]。國內(nèi)外大量實踐證明,培育并推廣抗病品種是防治小麥黃花葉病毒病最為經(jīng)濟有效的措施。目前,小麥抗病毒研究僅得到少量的抗病毒病相關(guān)基因,亟需挖掘新的基因資源。利用病毒基因?qū)χ参镞M行遺傳改良是近年來新出現(xiàn)的病害防治方法,原理包括利用病毒外殼蛋白、病毒復(fù)制酶、病毒運動蛋白介導(dǎo)的抗性途徑等來增強植物的抗病性,以病毒外殼蛋白介導(dǎo)的抗病性應(yīng)用最為廣泛[8]。自ABEL等[9]報道獲得攜帶煙草Nicotiana tabacum花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的外殼蛋白轉(zhuǎn)基因植株后,黃瓜Cucumis sativus花葉病毒(cucumber mosaic virus,CMV)[10]、 馬鈴薯 Solanum tuberosum Y 屬病毒(potato virus Y,PVY)[11]、 玉米Zea mays矮花葉病毒(maize dwarf mosaic virus,MDMV)[12]等重組外殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植株相繼出現(xiàn)。該抗病性的機制目前存在3種假說:一是認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中形成的外殼蛋白一定程度上抑制了病毒外殼蛋白的脫殼,二是認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植株在RNA水平上通過依賴同源序列的酶降解mRNA從而獲得抗性,三是認(rèn)為當(dāng)病毒的核酸進入細(xì)胞后,立即被細(xì)胞中的自由外殼蛋白重新包裹,從而抑制了病毒的侵染[13-16]。此外,有研究表明:病毒外殼蛋白介導(dǎo)的抗性途徑不僅對該種病毒存在抗性,在某些情況下對該病毒的不同菌株以及近緣病毒也存在抗性[13]。本研究擬利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法將CWMV的外殼蛋白基因?qū)霟煵荩@得陽性轉(zhuǎn)基因植株后,通過抗病性鑒定證實轉(zhuǎn)基因煙草對CWMV的抗病性,以期提高寄主植物的抗病性,并為利用病毒基因培育小麥抗病材料奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 植物表達載體的構(gòu)建

    根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中CWMV的外殼蛋白基因序列(登錄號:NP_059483.1)設(shè)計上游引物CP-F(5′-CGCGGATCCATGGCCGTGAAATCTGGTTAT-3′,下劃線部分為 BamHⅠ酶切位點)和下游引物 CP-R(5′-ACGCGTCGACACTCGAACCTTCCCACTTAAG-3′,下劃線部分為SalⅠ酶切位點),擴增得到外殼蛋白基因全長。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)參數(shù)為 94℃ 5 min;94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 60 s,循環(huán) 35次;72℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離。將膠回收產(chǎn)物連接至PCV-GFP載體上,構(gòu)建含有外殼蛋白基因的表達載體PCV-CP-GFP。

    1.2 總RNA的制備

    利用RNA提取試劑盒(HiPure Plant RNA Mini Kit)提取煙草葉片總RNA,利用分光光度計檢測RNA的濃度和純度,D(260)/D(280)讀數(shù)在1.8~2.1表明提取的RNA符合要求。

    1.3 RNA反轉(zhuǎn)錄與PCR檢測

    將RNA定量到1 μg,按照 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書完成 cDNA的合成。用雙蒸水將得到的cDNA產(chǎn)物稀釋10倍并作為模板,以CP-1F(5′-ATGGCCGTGAAATCTGGTTAT-3′)和CP-2R(5′-CTCGAACCTTCCCACTTAAG-3′)為引物進行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,35次循環(huán)。

    1.4 實時定量PCR與實時定量PCR引物設(shè)計

    根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫核苷酸序列信息,通過Prime 5.0軟件,設(shè)計檢測小麥的實時定量PCR引物,引物為 qRTMP-F(5′-TGAAGCGGTTGGTGCAAATG-3′)和 qRTMP-R(5′-GCCCGAATCGAGCAGTGATA-3′),由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。使用SYBR premix ExTaqⅡ試劑盒(TaKaRa)在熒光定量PCR-7900(ABI)上進行實時熒光定量PCR(RT-PCR)反應(yīng),反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s,65℃退火30 s,72℃延伸30 s,35次循環(huán)。

    1.5 煙草葉片總蛋白質(zhì)的提取

    稱取0.2 g處理后的煙草葉片放入2.0 mL離心管中震蕩研磨,加入200 μL蛋白裂解液,劇烈震蕩混勻3 min,冰上靜置5 min,4℃下5 000 r·min-1離心5 min。吸取上清液200 μL至新的1.5 mL離心管并加入48 μL的5×SDS緩沖液,沸水浴中煮沸10 min,冰上放置5 min。量取10 μL經(jīng)ExpressPlusTMPAGE Gels跑膠檢測(140 V, 50 min)。

    1.6 Western Blot印記分析

    利用半干轉(zhuǎn)膜儀,將跑膠后得到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜(NC膜),并利用封閉液(50 g·L-1脫脂牛奶)封閉1 h。取V[綠色熒光蛋白(GFP)特異性抗體]∶V(封閉緩沖液)=1∶5 000混合,放入NC膜,室溫孵育1 h后用1×PBS洗脫3次,15 min·次-1。將NC膜置于封閉緩沖液中(與HRP標(biāo)記的兔抗按10 000∶1比例混合)室溫孵育1 h,1×PBS洗3次,15 min·次-1。加入Novex ECL HRP Chemiluminescent Substrate Reagent Kit顯色液,并用Amersham imager 600成像系統(tǒng)成像。

    1.7 DNA的提取

    利用DNA提取試劑盒(HiPure SF Plant DNA Mini Kit)提取煙草葉片DNA,利用分光光度計檢測DNA濃度和純度,D(260)/D(280)讀數(shù)在1.8~2.0表明提取的DNA符合要求。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 轉(zhuǎn)基因苗的獲得

    利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法[11]將1.1中構(gòu)建的表達載體(PCV-CP-GFP)轉(zhuǎn)至本氏煙中。通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得表達外殼蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草(OECP),共獲得10個株系,20株·株系-1,移苗并栽培至4葉期,其中OECP-4和OECP-6株系的煙草沒有存活。隨機挑選存活10株·株系-1轉(zhuǎn)基因苗,提取總蛋白質(zhì)進行免疫分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):OECP-1、OECP-3、OECP-7、OECP-9表達量較低,而OECP-10、OECP-8、OECP-5、OECP-2這4個株系表達量較高,條帶大小為43 kDa,與CP-GFP蛋白大小一致(圖1)。為進一步證實得到的轉(zhuǎn)基因植株為陽性植株,提取樣株DNA進行PCR檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn):OECP-10、OECP-8、OECP-5、OECP-2均擴增出約530 bp的片段,與CWMV外殼蛋白基因大小一致(圖2)。表明外殼蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草中能夠正常表達。

    圖1 轉(zhuǎn)基因煙草的Western-Blot檢測Figure 1 Western-Blot analysisin differenttransgenic tobacco plants

    圖2 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測Figure 2 PCR analysis in different transgenic tobacco plants

    2.2 外殼蛋白轉(zhuǎn)基因煙草出現(xiàn)矮化表型

    篩選到的OECP陽性植株放置于25℃的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)2個月,觀察發(fā)現(xiàn):與野生型本氏煙草相比,OECP-2和OECP-8的陽性煙草植株出現(xiàn)了矮化表型(表1)。OECP-8與野生型的平均株高比為1.00∶0.65,OECP-2與野生型的平均株高比為1.00∶0.43,表明外殼蛋白干擾了煙草植株的正常生長。

    表1 轉(zhuǎn)基因煙草的株高Table 1 Plant height of transgenic tobaccos

    2.3 外殼蛋白轉(zhuǎn)基因煙草對CWMV的抗病性

    對OECP-2及OECP-8接種CWMV并栽植7 d,之后提取系統(tǒng)葉RNA,并檢測其植株中運動蛋白(move protein,MP)基因的表達量。由圖3可知:轉(zhuǎn)基因植株中CWMV的運動蛋白基因表達量顯著低于對照植株,表明表達外殼蛋白基因提高了煙草對CWMV的抗病性。

    3 討論

    近年來,外殼蛋白介導(dǎo)的抗病毒途徑是應(yīng)用最為成熟的提高寄主抗病性的方法之一,獲得的抗病性也更為高效[13]。本研究共獲得了OECP-10、OECP-8、OECP-5和OECP-2等4個高表達外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因煙草株系,對OECP-8和OECP-2株系接種CWMV,植株對CWMV的抗病性顯著提高。說明CWMV外殼蛋白介導(dǎo)的抗病毒途徑可被用作培育寄主的抗病材料。

    外殼蛋白介導(dǎo)的抗病性分別從蛋白質(zhì)水平和RNA水平發(fā)揮功能。當(dāng)病毒入侵進入植物體后,細(xì)胞內(nèi)的外殼蛋白會立刻包裹病毒核酸從而阻止病毒的翻譯與復(fù)制或直接引起病毒的脫殼;此外,植物還會通過依賴同源序列的酶降解病毒mRNA[14-16]。將病毒外殼蛋白基因融入植株中從而使轉(zhuǎn)基因植株獲得抗性已應(yīng)用于多種病毒與植株互作體系中[9-12]。本研究利用煙草與CWMV互作體系,成功將CWMV的外殼蛋白基因?qū)胫翢煵荩@著提高了煙草對CWMV的抗病性,進一步驗證了病毒外殼蛋白基因融入植株后會使轉(zhuǎn)基因植株獲得抗性。但本研究也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草出現(xiàn)矮化現(xiàn)象,說明融入外源基因影響煙草的正常生長,降低了轉(zhuǎn)基因煙草的品質(zhì)。與先前研究表明抗病性轉(zhuǎn)基因植株會出現(xiàn)生長發(fā)育異常,器官變異進而影響品質(zhì)[17]的結(jié)論一致。今后研究不僅要致力于培育具高抗的轉(zhuǎn)基因植株,還要在提高技術(shù)水平時盡量保證其產(chǎn)品的優(yōu)良品質(zhì),更好地滿足人類生活所需。

    圖3 接種中國小麥花葉病毒后轉(zhuǎn)基因煙草CWMV運動蛋白表達量檢測Figure 3 qRT-PCR analysisofthe transgenic tobacco plants

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