表達中國小麥花葉病毒（CWMV）外殼蛋白基因增強煙草對CWMV的抗病性

楊 錦，靳 鵬，劉 芃，羊 健，王 洋，戴良英，陳劍平

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，湖南 長沙410000；2.寧波大學(xué) 植物病毒研究所，浙江 寧波315000；3.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州311300）

中國小麥花葉病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）是引起小麥Triticum aestivum黃花葉病的重要病原體，嚴(yán)重威脅小麥的生產(chǎn)安全[1]。CWMV病毒直徑約為20 nm，長度為80～360 nm[2]，包含2條正義RNA（ssRNA）鏈，根據(jù)大小分別命名為RNA1和RNA2。CWMV-RNA1全長7 147 nt，編碼甲基轉(zhuǎn)移酶、 RNA聚合酶蛋白（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）和運動蛋白（movement protein，MP）等3個完整蛋白質(zhì)，分子量分別是153、212和37 kDa[3]。CWMV-RNA2全長3 563 nt，編碼病毒外殼蛋白（coat protein，CP）、N-CP蛋白（cystein rich protein，CRP）、CP-RT蛋白和1個富含半胱氨酸蛋白等4個蛋白質(zhì)，分子量分別是19、25、84及18～19 kDa。CWMV以根部專性寄生的禾谷多黏菌Polymyxa graminis為介體傳播[4-5]。當(dāng)帶毒的禾谷多黏菌侵染植株后，病毒會在寄主體內(nèi)不斷復(fù)制使植株發(fā)病；未帶毒的禾谷多黏菌通過侵染帶毒植株后獲得病毒，成為新的病源侵染其他植株[6]，且常與小麥黃花葉病毒（wheat yellow mosaic virus，WYMV）復(fù)合侵染[7]；由于禾谷多黏菌的休眠孢子具有極強的抗逆性，小麥黃花葉病毒病的防治難度大大增加[6]，患病小麥出現(xiàn)花葉、黃化、分蘗增生等癥狀[2]。國內(nèi)外大量實踐證明，培育并推廣抗病品種是防治小麥黃花葉病毒病最為經(jīng)濟有效的措施。目前，小麥抗病毒研究僅得到少量的抗病毒病相關(guān)基因，亟需挖掘新的基因資源。利用病毒基因?qū)χ参镞M行遺傳改良是近年來新出現(xiàn)的病害防治方法，原理包括利用病毒外殼蛋白、病毒復(fù)制酶、病毒運動蛋白介導(dǎo)的抗性途徑等來增強植物的抗病性，以病毒外殼蛋白介導(dǎo)的抗病性應(yīng)用最為廣泛[8]。自ABEL等[9]報道獲得攜帶煙草Nicotiana tabacum花葉病毒（tobacco mosaic virus,TMV）的外殼蛋白轉(zhuǎn)基因植株后，黃瓜Cucumis sativus花葉病毒（cucumber mosaic virus,CMV）[10]、 馬鈴薯 Solanum tuberosum Y 屬病毒（potato virus Y,PVY）[11]、 玉米Zea mays矮花葉病毒（maize dwarf mosaic virus,MDMV）[12]等重組外殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植株相繼出現(xiàn)。該抗病性的機制目前存在3種假說：一是認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中形成的外殼蛋白一定程度上抑制了病毒外殼蛋白的脫殼，二是認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植株在RNA水平上通過依賴同源序列的酶降解mRNA從而獲得抗性，三是認(rèn)為當(dāng)病毒的核酸進入細(xì)胞后，立即被細(xì)胞中的自由外殼蛋白重新包裹，從而抑制了病毒的侵染[13-16]。此外，有研究表明：病毒外殼蛋白介導(dǎo)的抗性途徑不僅對該種病毒存在抗性，在某些情況下對該病毒的不同菌株以及近緣病毒也存在抗性[13]。本研究擬利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法將CWMV的外殼蛋白基因?qū)霟煵荩@得陽性轉(zhuǎn)基因植株后，通過抗病性鑒定證實轉(zhuǎn)基因煙草對CWMV的抗病性，以期提高寄主植物的抗病性，并為利用病毒基因培育小麥抗病材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物表達載體的構(gòu)建

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）數(shù)據(jù)庫中CWMV的外殼蛋白基因序列（登錄號：NP_059483.1）設(shè)計上游引物CP-F（5′-CGCGGATCCATGGCCGTGAAATCTGGTTAT-3′，下劃線部分為 BamHⅠ酶切位點）和下游引物 CP-R（5′-ACGCGTCGACACTCGAACCTTCCCACTTAAG-3′，下劃線部分為SalⅠ酶切位點），擴增得到外殼蛋白基因全長。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）參數(shù)為 94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，循環(huán) 35次；72℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離。將膠回收產(chǎn)物連接至PCV-GFP載體上，構(gòu)建含有外殼蛋白基因的表達載體PCV-CP-GFP。

1.2 總RNA的制備

利用RNA提取試劑盒（HiPure Plant RNA Mini Kit）提取煙草葉片總RNA，利用分光光度計檢測RNA的濃度和純度，D（260）/D（280）讀數(shù)在1.8～2.1表明提取的RNA符合要求。

1.3 RNA反轉(zhuǎn)錄與PCR檢測

將RNA定量到1 μg，按照 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書完成 cDNA的合成。用雙蒸水將得到的cDNA產(chǎn)物稀釋10倍并作為模板，以CP-1F（5′-ATGGCCGTGAAATCTGGTTAT-3′）和CP-2R（5′-CTCGAACCTTCCCACTTAAG-3′）為引物進行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35次循環(huán)。

1.4 實時定量PCR與實時定量PCR引物設(shè)計

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫核苷酸序列信息，通過Prime 5.0軟件，設(shè)計檢測小麥的實時定量PCR引物，引物為 qRTMP-F（5′-TGAAGCGGTTGGTGCAAATG-3′）和 qRTMP-R（5′-GCCCGAATCGAGCAGTGATA-3′），由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。使用SYBR premix ExTaqⅡ試劑盒（TaKaRa）在熒光定量PCR-7900（ABI）上進行實時熒光定量PCR（RT-PCR）反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，35次循環(huán)。

1.5 煙草葉片總蛋白質(zhì)的提取

稱取0.2 g處理后的煙草葉片放入2.0 mL離心管中震蕩研磨，加入200 μL蛋白裂解液，劇烈震蕩混勻3 min，冰上靜置5 min，4℃下5 000 r·min-1離心5 min。吸取上清液200 μL至新的1.5 mL離心管并加入48 μL的5×SDS緩沖液，沸水浴中煮沸10 min，冰上放置5 min。量取10 μL經(jīng)ExpressPlusTMPAGE Gels跑膠檢測（140 V， 50 min）。

1.6 Western Blot印記分析

利用半干轉(zhuǎn)膜儀，將跑膠后得到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜（NC膜），并利用封閉液（50 g·L-1脫脂牛奶）封閉1 h。取V[綠色熒光蛋白（GFP）特異性抗體]∶V（封閉緩沖液）=1∶5 000混合，放入NC膜，室溫孵育1 h后用1×PBS洗脫3次，15 min·次-1。將NC膜置于封閉緩沖液中（與HRP標(biāo)記的兔抗按10 000∶1比例混合）室溫孵育1 h，1×PBS洗3次，15 min·次-1。加入Novex ECL HRP Chemiluminescent Substrate Reagent Kit顯色液，并用Amersham imager 600成像系統(tǒng)成像。

1.7 DNA的提取

利用DNA提取試劑盒（HiPure SF Plant DNA Mini Kit）提取煙草葉片DNA，利用分光光度計檢測DNA濃度和純度，D（260）/D（280）讀數(shù)在1.8～2.0表明提取的DNA符合要求。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因苗的獲得

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法[11]將1.1中構(gòu)建的表達載體（PCV-CP-GFP）轉(zhuǎn)至本氏煙中。通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得表達外殼蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草（OECP），共獲得10個株系，20株·株系-1，移苗并栽培至4葉期，其中OECP-4和OECP-6株系的煙草沒有存活。隨機挑選存活10株·株系-1轉(zhuǎn)基因苗，提取總蛋白質(zhì)進行免疫分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：OECP-1、OECP-3、OECP-7、OECP-9表達量較低，而OECP-10、OECP-8、OECP-5、OECP-2這4個株系表達量較高，條帶大小為43 kDa，與CP-GFP蛋白大小一致（圖1）。為進一步證實得到的轉(zhuǎn)基因植株為陽性植株，提取樣株DNA進行PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：OECP-10、OECP-8、OECP-5、OECP-2均擴增出約530 bp的片段，與CWMV外殼蛋白基因大小一致（圖2）。表明外殼蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草中能夠正常表達。

圖1 轉(zhuǎn)基因煙草的Western-Blot檢測Figure 1 Western-Blot analysisin differenttransgenic tobacco plants

圖2 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測Figure 2 PCR analysis in different transgenic tobacco plants

2.2 外殼蛋白轉(zhuǎn)基因煙草出現(xiàn)矮化表型

篩選到的OECP陽性植株放置于25℃的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)2個月，觀察發(fā)現(xiàn)：與野生型本氏煙草相比，OECP-2和OECP-8的陽性煙草植株出現(xiàn)了矮化表型（表1）。OECP-8與野生型的平均株高比為1.00∶0.65，OECP-2與野生型的平均株高比為1.00∶0.43，表明外殼蛋白干擾了煙草植株的正常生長。

表1 轉(zhuǎn)基因煙草的株高Table 1 Plant height of transgenic tobaccos

2.3 外殼蛋白轉(zhuǎn)基因煙草對CWMV的抗病性

對OECP-2及OECP-8接種CWMV并栽植7 d，之后提取系統(tǒng)葉RNA，并檢測其植株中運動蛋白（move protein，MP）基因的表達量。由圖3可知：轉(zhuǎn)基因植株中CWMV的運動蛋白基因表達量顯著低于對照植株，表明表達外殼蛋白基因提高了煙草對CWMV的抗病性。

3 討論

近年來，外殼蛋白介導(dǎo)的抗病毒途徑是應(yīng)用最為成熟的提高寄主抗病性的方法之一，獲得的抗病性也更為高效[13]。本研究共獲得了OECP-10、OECP-8、OECP-5和OECP-2等4個高表達外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因煙草株系，對OECP-8和OECP-2株系接種CWMV，植株對CWMV的抗病性顯著提高。說明CWMV外殼蛋白介導(dǎo)的抗病毒途徑可被用作培育寄主的抗病材料。

外殼蛋白介導(dǎo)的抗病性分別從蛋白質(zhì)水平和RNA水平發(fā)揮功能。當(dāng)病毒入侵進入植物體后，細(xì)胞內(nèi)的外殼蛋白會立刻包裹病毒核酸從而阻止病毒的翻譯與復(fù)制或直接引起病毒的脫殼；此外，植物還會通過依賴同源序列的酶降解病毒mRNA[14-16]。將病毒外殼蛋白基因融入植株中從而使轉(zhuǎn)基因植株獲得抗性已應(yīng)用于多種病毒與植株互作體系中[9-12]。本研究利用煙草與CWMV互作體系，成功將CWMV的外殼蛋白基因?qū)胫翢煵荩@著提高了煙草對CWMV的抗病性，進一步驗證了病毒外殼蛋白基因融入植株后會使轉(zhuǎn)基因植株獲得抗性。但本研究也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草出現(xiàn)矮化現(xiàn)象，說明融入外源基因影響煙草的正常生長，降低了轉(zhuǎn)基因煙草的品質(zhì)。與先前研究表明抗病性轉(zhuǎn)基因植株會出現(xiàn)生長發(fā)育異常，器官變異進而影響品質(zhì)[17]的結(jié)論一致。今后研究不僅要致力于培育具高抗的轉(zhuǎn)基因植株，還要在提高技術(shù)水平時盡量保證其產(chǎn)品的優(yōu)良品質(zhì)，更好地滿足人類生活所需。

圖3 接種中國小麥花葉病毒后轉(zhuǎn)基因煙草CWMV運動蛋白表達量檢測Figure 3 qRT-PCR analysisofthe transgenic tobacco plants