火焰南天竹莖段離體培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化

葉 雯，袁超群，秦 偉，王振濤，朱玉球

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州311300；2.嘉興中瑞生物科技有限公司，浙江 嘉興 314051）

火焰南天竹Nandina domestica‘Firepower’為園藝新品種，植株矮小、株型緊湊，莖節(jié)短，只有南天竹N.domestica的1/10，葉片呈卵形或者橢圓形，和南天竹披針形葉存在著明顯的區(qū)別[1-4]。當(dāng)氣溫下降到5℃以下且晝夜溫差超過(guò)10℃時(shí)，葉片呈火紅色，經(jīng)霜不落，春夏季呈淡綠色，極具觀賞價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場(chǎng)需求量大[1-2]。常采用扦插繁殖，繁殖周期較長(zhǎng)，繁殖率極低，并且扦插容易感染病毒，造成品質(zhì)退化。已有報(bào)道利用組織培養(yǎng)技術(shù)解決火焰南天竹繁殖數(shù)量少、繁殖速度慢、種質(zhì)易退化等缺點(diǎn)[3-10]，雖然能夠通過(guò)愈傷組織、莖尖和葉片等作為外植體獲得不定芽，但增殖系數(shù)相對(duì)較低[6,11]。有些雖然能夠大規(guī)模生產(chǎn)，培養(yǎng)基配方中使用蔗糖[12]，成本較高，距規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還有一定的差距。鑒于此，本研究以火焰南天竹不帶葉莖段為外植體，進(jìn)行離體快繁影響關(guān)鍵因子優(yōu)化，建立適合大規(guī)模生產(chǎn)的火焰南天竹莖段離體快速繁殖技術(shù)體系，旨在為火焰南天竹種苗高效、快捷和穩(wěn)定生產(chǎn)提供技術(shù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

火焰南天竹由嘉興中瑞生物科技有限公司提供。選擇生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的火焰南天竹優(yōu)良單株的嫩枝條為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 火焰南天竹芽生長(zhǎng)基本培養(yǎng)基篩選 以1/2MS、WPM、DCR、B5為基本培養(yǎng)基，分別添加6-芐基腺嘌呤（6-BA）0.50 mg·L-1，萘乙酸（NAA）0.20 mg·L-1， 蔗糖 30.0 g·L-1，卡拉膠 7.0 g·L-1（pH 5.8），進(jìn)行芽生長(zhǎng)基本培養(yǎng)基篩選。選取長(zhǎng)0.5～1.0 cm帶節(jié)莖段，保持極性，接種于不同篩選培養(yǎng)基上，接種莖段10個(gè)·瓶-1，每種培養(yǎng)基接種10瓶，于1 500～3 000 lx光照，（25±2）℃培養(yǎng)40 d后，觀察和統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)、增殖和生長(zhǎng)情況。

1.2.2 不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA配比對(duì)火焰南天竹芽誘導(dǎo)和增殖的影響 選取1.2.1篩選的理想基本培養(yǎng)基， 添加不同質(zhì)量濃度 6-BA（0、0.25、 0.50、0.75、 1.00 mg·L-1）和 NAA（0.10、0.50 mg·L-1）組成 10種不同配方培養(yǎng)基，以初代培養(yǎng)獲得無(wú)菌芽苗為試材，剪取帶節(jié)的莖段，接種在培養(yǎng)基上，接種莖段10個(gè)·瓶-1，培養(yǎng)條件同1.2.1。培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)、增殖情況。

1.2.3 火焰南天竹幼苗的生根培養(yǎng) ①生根基本培養(yǎng)基的篩選。選取約3 cm高的無(wú)菌芽苗，分別接種在添加 0.25 mg·L-1IBA+0.25 mg·L-1NAA+30.0 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉膠（pH 5.8）的 1/2MS 和 1/2WPM基本培養(yǎng)基上。接種芽苗10株·瓶-1，每種培養(yǎng)基接10瓶。②生根最佳NAA質(zhì)量濃度的篩選。選取約3 cm高的芽苗分別接種在添加不同質(zhì)量濃度（0.10、 0.30、 0.50 mg·L-1）NAA， 30.0 g·L-1蔗糖， 7.0 g·L-1卡拉膠（pH 5.8）的生根理想基本培養(yǎng)基上，接種芽苗10株·瓶-1，每種培養(yǎng)基接10瓶。③生根白砂糖質(zhì)量濃度的篩選。蔗糖是組織培養(yǎng)中最好的碳源，但種苗規(guī)?；a(chǎn)過(guò)程中，降低成本是很有必要的，為此研究白砂糖不同質(zhì)量濃度對(duì)火焰南天竹生根的影響。選取約3 cm高的芽苗，分別接種于20.0、30.0、40.0 g·L-1白砂糖的生根培養(yǎng)基（pH 5.8）上，以30.0 g·L-1蔗糖為對(duì)照。接種芽苗10株·瓶-1，每種培養(yǎng)基接10瓶。④試管苗生長(zhǎng)的最佳pH值篩選。將約3 cm高的芽苗分別接種于不同pH值（5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4、8.8、9.2）的生根培養(yǎng)基上，接種芽苗10株·瓶-1， 每種培養(yǎng)基接10瓶。以上篩選試驗(yàn)培養(yǎng)條件同1.2.1，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.4 培養(yǎng)條件的篩選 將0.5～1.0 cm長(zhǎng)帶節(jié)火焰南天竹莖段接種在前期篩選的芽誘導(dǎo)、增殖和生根的最佳培養(yǎng)基上，接種后分別暗培養(yǎng)0、5、15 d后，于1 500～3 000 lx光照，時(shí)間12 h·d-1，（25±2）℃下進(jìn)行芽誘導(dǎo)、芽增殖、生根培養(yǎng)等試驗(yàn)，每處理接種10瓶，外植體10個(gè)·瓶-1，統(tǒng)計(jì)其生長(zhǎng)情況，篩選出各培養(yǎng)階段的合適條件。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Excell和SPSS 17.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。芽誘導(dǎo)率、生根率和芽增殖系數(shù)計(jì)算公式如下：芽誘導(dǎo)率=出芽外植體數(shù)/接種數(shù)×100%；生根率=生根外植體數(shù)/接種數(shù)×100%；芽增殖系數(shù)=外植體誘導(dǎo)芽數(shù)/外植體接種數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對(duì)火焰南天竹芽生長(zhǎng)的影響

由表1可知：基本培養(yǎng)基對(duì)火焰南天竹芽誘導(dǎo)有明顯的影響。DCR對(duì)火焰南天竹的芽誘導(dǎo)效果最好，出芽率高達(dá)96.8%；其次是WPM和1/2MS，芽誘導(dǎo)率分別為90.2%和85.0%，而B(niǎo)5的芽誘導(dǎo)率只有43.2%。因此，選擇DCR火焰南天竹莖段芽誘導(dǎo)較理想的基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)40 d后，在WPM上，芽的增殖倍數(shù)和芽高分別為3.18和1.18 cm，植株生長(zhǎng)健壯，葉色綠色，葉片舒展寬大；在DCR上芽增殖倍數(shù)為2.05，芽高0.95 cm，植株生長(zhǎng)正常，葉色綠色，但葉小卷曲。而在1/2MS和B5培養(yǎng)基上，芽的增殖位數(shù)僅為1.52和1.06。4種基本培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度從高到低依次為B5、1/2MS、DCR、WPM，因此，可以推斷低質(zhì)量濃度無(wú)機(jī)鹽有利于火焰南天竹芽誘導(dǎo)、繁殖和生長(zhǎng)。因此，綜合芽誘導(dǎo)、增殖和植株生長(zhǎng)情況等，選擇WPM為本試驗(yàn)的理想基本培養(yǎng)基。

表1 基本培養(yǎng)基對(duì)火焰南天竹出芽的影響Table 1 Effect of basic media on rooting of N.domestica‘Firepower’

2.2 6-BA和NAA對(duì)火焰南天竹芽誘導(dǎo)與芽增殖的影響

由圖1可見(jiàn)：6-BA和NAA的質(zhì)量濃度對(duì)芽的誘導(dǎo)和增殖影響差異極顯著（P=0.000 1）。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，火焰南天竹的出芽率及芽的增殖倍數(shù)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)6-BA達(dá)1.00 mg·L-1時(shí)，出芽率及芽的增殖倍數(shù)達(dá)最高值，但芽生長(zhǎng)緩慢，葉小，葉片皺褶卷曲，新生幼葉脆弱，易玻璃化，不利于芽苗的生長(zhǎng)。綜合分析表明：芽誘導(dǎo)理想培養(yǎng)基為WPM+0.50 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，芽誘導(dǎo)率高達(dá)93.0%；芽增殖的理想培養(yǎng)基為WPM+0.75 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，芽增殖倍數(shù)為3.3，新芽生長(zhǎng)良好，葉片舒展寬大，葉色鮮綠（圖2A）。方差分析可知：6-BA和NAA兩者互作的差異不顯著（P=0.998 1）。

2.3 火焰南天竹試管苗生根條件的篩選

2.3.1 基本培養(yǎng)基對(duì)火焰南天竹試管苗生根的影響 由表2可見(jiàn)：基本培養(yǎng)基對(duì)火焰南天竹試管苗生根有一定的影響，火焰南天竹在WPM上的生根優(yōu)于1/2MS培養(yǎng)基，在WPM上的生根率、平均根數(shù)分別是1/2MS的3.1和2.6倍，且試管苗生長(zhǎng)良好，葉片舒展、鮮綠色。因此，低質(zhì)量濃度無(wú)機(jī)鹽的WPM培養(yǎng)基有利于試管苗生根和生長(zhǎng)。

2.3.2 NAA對(duì)火焰南天竹試管苗生根的影響 由表3可知：NAA質(zhì)量濃度對(duì)火焰南天竹芽苗生根影響明顯，隨著NAA質(zhì)量濃度的增加，試管苗的生根率、平均生根數(shù)有明顯增加，但對(duì)根長(zhǎng)的生長(zhǎng)影響不明顯。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度達(dá)0.50 mg·L-1時(shí)，試管苗生根率高達(dá)91.0%，平均根數(shù)為5.4根，試管苗生長(zhǎng)正常。

圖1 不同培養(yǎng)基組合對(duì)火焰南天竹不定芽誘導(dǎo)率和芽增殖倍數(shù)的影響Figure 1 Effects of different media combinations on adventitious bud induction rate and bud proliferation times of N.domestica‘Firepower’

表2 基本培養(yǎng)基對(duì)火焰南天竹生根的影響Table 2 Effect of basic media on rooting of N.domestica‘Firepower’

表3 NAA對(duì)火焰南天竹生根的影響Table 3 Effect of NAA on rooting of N.domestica‘Firepower’

2.3.3 白砂糖濃度對(duì)火焰南天竹生根的影響 由表4可知：添加白砂糖30.0 mg·L-1的培養(yǎng)基中火焰南天竹的生根率可達(dá)90.4%，平均根數(shù)達(dá)5.1且植株正常，生長(zhǎng)較好，葉片綠色（圖2B和2C），與添加蔗糖30.0 mg·L-1的培養(yǎng)基中的生根差異不顯著。綜合成本和生根情況考慮，大規(guī)模種苗生產(chǎn)過(guò)程中，可用相同質(zhì)量濃度的白砂糖替代蔗糖作為碳源。

表4 白砂糖質(zhì)量濃度對(duì)火焰南天竹生根的影響Table 4 Effect of sugar on rooting of N.domestica‘Firepower’

2.3.4 pH值對(duì)火焰南天竹生根的影響 由表5可見(jiàn)：pH為6.0時(shí)，生根率達(dá)95.0%，平均生根數(shù)和根長(zhǎng)分別為6.1根和1.07 cm，好于其他pH的生根情況。當(dāng)pH≥6.2時(shí)，火焰南天竹生根的各項(xiàng)指標(biāo)明顯下降，致使植株瘦弱，生長(zhǎng)緩慢甚至停止生長(zhǎng)。因此，火焰南天竹生根培養(yǎng)基的最佳pH為6.0。

表5 pH值對(duì)火焰南天竹生根的影響Table 5 Effect of pH value on rooting of N.domestica‘Firepower’

2.4 培養(yǎng)條件對(duì)芽誘導(dǎo)、增殖和生根的影響

在火焰南天竹的組培過(guò)程中器官的形成所需培養(yǎng)條件不同，接種后暗培養(yǎng)5 d后轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)有利于芽的誘導(dǎo)和增殖；生根培養(yǎng)條件為接種后在光強(qiáng)1 500～3 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1，溫度為（25±2）℃ 條件下培養(yǎng)（表6）。

表6 培養(yǎng)條件對(duì)芽誘導(dǎo)、增殖和生根的影響Table 6 Effect of culture conditions on rooting of N.domestica‘Firepower’

圖2 火焰南天竹不定芽誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)Figure 2 Adventitious bud induction,proliferation and rooting culture of N.domestica‘Firepower’

3 結(jié)論

節(jié)間較短，枝條細(xì)弱，株形矮小，枝條數(shù)量有限，這些制約了火焰南天竹的分株和扦插繁殖，使火焰南天竹不能滿足市場(chǎng)的需求[11-12]。為了擴(kuò)大火焰南天竹的繁殖率，近年來(lái)植物組織培養(yǎng)技術(shù)已應(yīng)用于火焰南天竹的繁殖，一定程度打破火焰南天竹自然繁殖力低的限制，加快繁育速度，但在生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)基因型和環(huán)境條件仍然制約著火焰南天竹擴(kuò)繁。本研究對(duì)影響火焰南天竹組織培養(yǎng)再生體系的關(guān)鍵因子進(jìn)行了優(yōu)化。糖是植物組織培養(yǎng)中提供培養(yǎng)物所需要的碳骨架和能源，是維持培養(yǎng)基穩(wěn)定的滲透壓不可缺少的碳源物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)：30.0 mg·L-1白砂糖和蔗糖分別作為碳源的培養(yǎng)效果差異不顯著，因此考慮到成本問(wèn)題，規(guī)?；a(chǎn)火焰南天竹時(shí)可用白砂糖代替蔗糖?；鹧婺咸熘裨嚬苊缟囵B(yǎng)基適宜的pH為5.8～6.0，尤以pH為6.0時(shí)生長(zhǎng)良好，與李慧[8]研究結(jié)果基本一致，同鄧玉營(yíng)等[9]的研究結(jié)果稍有出入，可能是由于所用火焰南天竹的基因型不一致所導(dǎo)致。

本研究以火焰南天竹莖段為材料，優(yōu)化了火焰南天竹的組織培養(yǎng)再生體系的影響因素，優(yōu)化的體系為：不定芽誘導(dǎo)理想培養(yǎng)基為WPM+0.50 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，不定芽增殖培養(yǎng)基為WPM+0.75 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA， 生根培養(yǎng)基為 1/2WPM+0.50 mg·L-1NAA+白砂糖 30.0 g·L-1，pH 6.0。