不同菜心品種萌發(fā)期和苗期耐熱性分析及其鑒定指標(biāo)篩選

龐強(qiáng)強(qiáng)，周 曼，孫曉東，陳貽誦，蔡興來(lái)

(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所/海南省蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571100)

菜心(BrassicacampestrisL. spp.chinensisvar.utilisTsen et Lee)，又名菜薹，為十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的一個(gè)變種，以花薹為主要食用器官，是中國(guó)華南地區(qū)的特產(chǎn)蔬菜之一[1]。菜心喜溫，其生長(zhǎng)適宜溫度為15～25 ℃，30 ℃以上高溫植株生長(zhǎng)就會(huì)受到阻礙[2]，導(dǎo)致菜薹葉片纖細(xì)，品質(zhì)下降，甚至死亡。海南島地處熱帶北緣，屬熱帶季風(fēng)氣候，素來(lái)有“天然大溫室”的美稱。隨著全球氣候變暖，海南島高溫日數(shù)也呈現(xiàn)出明顯增多的態(tài)勢(shì)[3]，高溫已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中面臨的主要問題之一。通過(guò)篩選、培育耐熱菜心品種是解決上述問題的必由之路，而合理選擇耐熱性鑒定指標(biāo)是進(jìn)行耐熱育種、耐熱機(jī)理及高溫調(diào)控緩解機(jī)制研究的基礎(chǔ)。

作物耐熱性鑒定及耐熱指標(biāo)篩選需要將不同指標(biāo)相結(jié)合，對(duì)各個(gè)時(shí)期進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以篩選出簡(jiǎn)單有效的耐熱性鑒定指標(biāo)和適宜的綜合評(píng)價(jià)方法[4]。種子萌發(fā)期和苗期是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要時(shí)期但又是最脆弱的時(shí)期[5]。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在作物萌發(fā)期和苗期耐熱性鑒定及耐熱指標(biāo)篩選方面開展了大量研究工作，同時(shí)提出了不同作物在不同條件下的鑒定指標(biāo)和評(píng)價(jià)體系[6-7]。在菜心耐熱適應(yīng)機(jī)制研究上，研究者發(fā)現(xiàn)高溫會(huì)導(dǎo)致菜心種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽力及發(fā)芽指數(shù)降低[8]，幼苗葉片內(nèi)甜菜堿、可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量及抗氧化酶活性顯著升高[1,9]；郭培國(guó)等[10]采用抑制差減雜交(SSH) 技術(shù)，構(gòu)建了一個(gè)高溫脅迫下在耐熱品種中特異表達(dá)的SSH cDNA 基因文庫(kù)，BLAST 分析發(fā)現(xiàn)99條ESTs代表81個(gè)基因可能與菜心的耐熱性相關(guān)。在菜心耐熱性指標(biāo)篩選研究方面，李光光等[11]通過(guò)隸屬函數(shù)法得到高溫塑料棚采收期的菜心株高、薹葉數(shù)、單株生物總質(zhì)量可用來(lái)評(píng)價(jià)菜心的耐熱性，并將6個(gè)菜心材料分為3類。李榮華等[12]認(rèn)為生物量和薹質(zhì)量可作為評(píng)價(jià)菜心耐熱性強(qiáng)弱的關(guān)鍵農(nóng)藝性狀指標(biāo)。綜合前人研究結(jié)果來(lái)看，當(dāng)前的研究主要集中在高溫脅迫對(duì)菜心的農(nóng)藝性狀指標(biāo)和生理生態(tài)響應(yīng)方面，而關(guān)于菜心萌發(fā)期和苗期耐熱性鑒定及其耐熱指標(biāo)篩選的研究并不常見，至今還未建立一套高效的菜心耐熱性鑒定體系和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用模擬高溫脅迫法，通過(guò)對(duì)菜心不同品種萌發(fā)期種子發(fā)芽指標(biāo)和苗期生長(zhǎng)及生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，以各單項(xiàng)指標(biāo)的耐熱系數(shù)為衡量單項(xiàng)耐熱能力的指標(biāo)，采用主成分分析法、隸屬函數(shù)法、聚類分析、關(guān)聯(lián)度分析、逐步回歸分析法對(duì)菜心耐熱性進(jìn)行鑒定和綜合評(píng)價(jià)，從而篩選出耐熱性強(qiáng)的菜心材料及易測(cè)定的與菜心種質(zhì)耐熱性密切相關(guān)的指標(biāo)，以期為菜心耐熱種質(zhì)的發(fā)掘及新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菜心品種20份(表1)，試驗(yàn)在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所永發(fā)試驗(yàn)基地和海南省蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

表1 參試菜心品種名稱及編號(hào)Table 1 Name and number of Chinese flowering cabbage cultivars in test

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 模擬高溫脅迫試驗(yàn) 以珍珠巖為基質(zhì)進(jìn)行穴盤育苗，常規(guī)栽培管理。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)移至25 ℃/18 ℃(晝/夜)，12 h/12 h(晝/夜)，光照覆蓋率80%，相對(duì)濕度90%的光照培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)3 d，之后進(jìn)行高溫處理。為明確不同基因型菜心萌發(fā)期和苗期高溫脅迫耐性的適宜篩選溫度，進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)，得出37 ℃/27 ℃能較好地反映不同品種耐熱性的差異。因此，選取37 ℃/27 ℃作為高溫脅迫處理溫度。以 25 ℃/18 ℃條件下正常生長(zhǎng)的幼苗為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 種子發(fā)芽試驗(yàn) 20個(gè)菜心品種分別選取100粒優(yōu)質(zhì)、飽滿的種子，去離子水中浸泡2 h后，在潔凈、烘干的培養(yǎng)皿中均勻擺入已干燥的種子，蓋上培養(yǎng)皿，分別放入不同溫度的培養(yǎng)箱中，讓其在黑暗中發(fā)芽，保持濾紙濕潤(rùn)，每個(gè)品種均設(shè)3次重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 發(fā)芽試驗(yàn)測(cè)定項(xiàng)目和方法 以胚根的長(zhǎng)度超過(guò)種子半徑視為發(fā)芽，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第14天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，具體計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率(GR)=發(fā)芽終期全部正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(1)

發(fā)芽勢(shì)(GP)=發(fā)芽初期正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(2)

活力指數(shù)(VI)=發(fā)芽指數(shù)GI×幼苗生長(zhǎng) 勢(shì)S

(3)

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)

(4)

式中，Gt為在t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為其相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析與評(píng)價(jià)方法

按照公式計(jì)算植株耐熱系數(shù)(γ)。

γ= 處理組測(cè)定值/對(duì)照組測(cè)定值

(5)

按照公式計(jì)算綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值 [u(Xi)]。

u(Xi)=(Xi-Xmin) /(Xmax-Xmin)i=1，2，3，…n

(6)

式中，u(Xi)表示第i個(gè)綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xi表示第i個(gè)綜合指標(biāo)值；Xmin、Xmax分別表示綜合指標(biāo)的最小值和最大值。

(7)

式中，Wi表示第i個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中重要程度；Pi表示第i個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

(8)

式中，D表示不同品種在高溫脅迫下綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)所得的綜合耐熱性評(píng)價(jià)值。

采用Microsoft Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用SPSS 22.0進(jìn)行方差和顯著性檢測(cè)，單因素分析采用Duncan’s法。采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)對(duì)各單項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，用主成分分析法進(jìn)行主因子分析，采用組間連接距離聚類法對(duì)各品種進(jìn)行聚類分析，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法分析各單項(xiàng)指標(biāo)的耐熱系數(shù)與參考序列的關(guān)聯(lián)度，采用逐步回歸分析法建立最優(yōu)回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菜心品種各單項(xiàng)指標(biāo)的耐熱系數(shù)和相關(guān)性分析

對(duì)初級(jí)指標(biāo)耐熱系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)生理指標(biāo)間存在不同程度的相關(guān)性(表3)，其中有的指標(biāo)間存在顯著的相關(guān)性，如活力指數(shù)與地上部鮮質(zhì)量(r=0.297，P<0.05)，可認(rèn)為活力指數(shù)與地上部鮮質(zhì)量提供的共同信息量為 29.7%。而有的指標(biāo)間存在極顯著的相關(guān)性，如發(fā)芽率與活力指數(shù)之間相關(guān)性顯著(r= 0.721，P<0.01 )，可認(rèn)為發(fā)芽率與活力指數(shù)提供的共同信息量為72.1%；發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)之間相關(guān)性顯著(r=0.621，P<0.01)，可認(rèn)為相發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)提供的共同信息量為62.1%，其余具有相關(guān)性的評(píng)價(jià)指標(biāo)間也存在著不同的信息重疊。因此，用某一個(gè)鑒定指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)不同菜心品種的耐熱性難以得到客觀的結(jié)果。為了彌補(bǔ)用單一指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)耐熱性的不足，在此基礎(chǔ)上需進(jìn)一步發(fā)掘能充分反映其在高溫脅迫條件下的耐熱性指標(biāo)。

表2 不同菜心品種各單項(xiàng)指標(biāo)的耐熱系數(shù)變異分析Table 2 Variation analysis of heat resistance coefficient of every individual indicator in different Chinese flowering cabbage cultivars

2.2 不同菜心品種各鑒定指標(biāo)的主成分分析

利用主成分分析法將21個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)換算成3個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，分別用主成分1、主成分2和主成分3表示(表4)，其貢獻(xiàn)率分別為 66.30%、8.22%和6.36%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到 80.88%，說(shuō)明這3個(gè)綜合指標(biāo)已經(jīng)包含菜心耐熱性的大部分信息。根據(jù)主成分分析原則，同一指標(biāo)的特征向量的最大絕對(duì)值所在的主成分即為其所屬主成分。各綜合指標(biāo)對(duì)應(yīng)的特征向量為：第1主成分(主成分1)z1=0.775GR+0.777GI+ 0.441VI+0.724GP+0.977FAW+0.911 FUW+0.890DAW+0.879DUW-0.911HDI+ 0.876Chl+0.758RA+0.169RSA-0.838SAR- 0.805HP-0.939RC-0.819MDA+0.881SS+0.933Pro+0.907SOD+0.562CAT+ 0.874POD，其中在地上部鮮質(zhì)量、相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有較高的載荷量；第2主成分(主成分2)z2=0.564GR +0.563GI+0.752VI+ 0.372GP-0.148FAW-0.190FUW- 0.230 DAW-0.134DUW+0.022HDI-0.153Chl- 0.077RA+0.058RSA+0.018SAR+0.138HP+0.128RC+0.247MDA+0.144SS-0.207Pro+0.002SOD-0.255CAT+0.028POD，其中在活力指數(shù)、發(fā)芽率上均有較高的載荷量；第3主成分(主成分3)z3=-0.021GR-0.020GI-0.178VI+0.037GP-0.011FAW-0.029FUW- 0.285DAW+0.334DUW+ 0.227HDI- 0.170Chl+0.261RA+0.949RSA-0.086SAR-0.035HP+0.093RC+0.117MDA+0.154SS+0.004Pro-0.028SOD+0.027 CAT+0.035 POD，其中在根冠比上有較高的載荷量。

表3 不同菜心品種各單項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 3 Correlation matrix of every individual indicator in different Chinese flowering cabbage cultivars

注： * 和**分別表示P<0.05 和P<0.01 的顯著水平。

Note: * and ** significant level atP<0.05 andP<0.01．

表4 各綜合指標(biāo)的系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 4 Coefficients and proportion of comprehensive indicators

2.3 不同菜心品種耐熱性綜合評(píng)價(jià)

2.3.1 隸屬函數(shù)分析 為進(jìn)一步明確3個(gè)綜合指標(biāo)對(duì)菜心高溫脅迫耐受性的貢獻(xiàn)率，采用隸屬函數(shù)分析法進(jìn)行菜心耐熱性綜合評(píng)價(jià)(表5)。首先對(duì)20個(gè)品種的耐熱系數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，再按公式(6)計(jì)算20個(gè)品種在3個(gè)綜合指標(biāo)中的隸屬函數(shù)值。同一綜合指標(biāo)下，隸屬函數(shù)值越大，表明菜心品種在這一綜合指標(biāo)上的耐熱性越強(qiáng)，反之則越弱。由表5可知，不同菜心品種的所有綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值不盡相同。對(duì)于同一綜合指標(biāo)z1而言，品種C3的u(X1)值最大為1，說(shuō)明C3菜心品種在z1這一綜合指標(biāo)上表現(xiàn)出的耐熱性最強(qiáng)，而C15的u(X1)值最小為0，說(shuō)明C15菜心品種在z1這一綜合指標(biāo)上表現(xiàn)出的耐熱性最弱。對(duì)于同一綜合指標(biāo)z2而言，C14的u(X2)值最大為1，說(shuō)明C14菜心品種在z2這一綜合指標(biāo)上表現(xiàn)出的耐高溫性最強(qiáng)，而C17的u(X2)值最小為0，說(shuō)明C17菜心品種在z2這一綜合指標(biāo)上表現(xiàn)出的耐高溫性最弱。對(duì)于同一綜合指標(biāo)z3而言，C15的u(X3)值最大為1，說(shuō)明C15菜心品種在z3這一綜合指標(biāo)上表現(xiàn)出的耐高溫性最強(qiáng)，而C5的u(X3)值最小為0，說(shuō)明C5菜心品種在z3這一綜合指標(biāo)上表現(xiàn)出的耐高溫性最弱。

2.3.2 各綜合指標(biāo)權(quán)重和綜合評(píng)價(jià) 通過(guò)公式(7)計(jì)算各綜合指標(biāo)在主成分貢獻(xiàn)率中的權(quán)重，從而得出3個(gè)綜合指標(biāo)權(quán)重分別為0.820、0.102、0.079。根據(jù)隸屬函數(shù)值和權(quán)重的計(jì)算結(jié)果，用公式(8)來(lái)量化每一品種的綜合耐熱性能的強(qiáng)弱。本研究中，D值為各品種耐熱性的綜合評(píng)價(jià)值，D值越大，表明材料的綜合耐熱性越強(qiáng)。由表5可知，通過(guò)對(duì)各品種的D值進(jìn)行排序得出，不同菜心材料耐熱性強(qiáng)弱順序?yàn)镃12>C9>C10>C3>C17>C4>C14>C8>C11>C19>C1>C5>C15>C18>C2>C6>C20>C13>C16>C7。

2.3.3 耐熱性聚類分析 采用組間連接距離聚類法對(duì)20個(gè)菜心品種的D值進(jìn)行耐熱性聚類分析，建立聚類樹狀圖。由圖1可知，可將20個(gè)菜心品種分為3類，即第Ⅰ類對(duì)高溫的耐受性較強(qiáng)，包括品種C3、C17、C4、C9、C10和C12；第Ⅱ類對(duì)高溫耐受性較差，包括品種C13、C16、C7和C20；第Ⅲ類對(duì)高溫的耐受性一般，包括品種C11、C19、C8、C14、C2、C6、C5、C15、C18和C1。

表5 不同菜心品種的耐熱綜合指標(biāo)值、權(quán)重、隸屬函數(shù)值、D值及綜合評(píng)價(jià)Table 5 Comprehensive indicator values,index weight,membership function values,D values and comprehensive evaluation of heat tolerance in different Chinese flowering cabbage cultivars

2.3.5 逐步回歸分析 為分析21個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)與不同菜心品種之間的耐熱性關(guān)系，篩選能夠客觀鑒定菜心耐熱性的指標(biāo)，建立可用于菜心萌發(fā)期和苗期耐熱性評(píng)價(jià)的數(shù)學(xué)模型，將耐熱性綜合評(píng)價(jià)值(D值)作為因變量，把各單項(xiàng)指標(biāo)的耐熱系數(shù)作為自變量進(jìn)行逐步回歸分析，建立最優(yōu)回歸方程：D=-0.767+0.861HDI+0.551POD+ 0.373MDA+ 0.018SS+0.112GP-0.014HP，該方程決定系數(shù)R2=0.995，F(xiàn)=401.96，顯著性水平P= 0.000 1，統(tǒng)計(jì)量為2.41。由方程可知，21個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)中有6個(gè)指標(biāo)對(duì)菜心耐熱性有顯著影響，分別是熱害指數(shù)、POD活性、MDA質(zhì)量摩爾濃度、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、發(fā)芽勢(shì)、H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，可有選擇性地測(cè)定與D值密切相關(guān)的指標(biāo)并求得耐熱系數(shù)，進(jìn)而利用該方程預(yù)測(cè)其他菜心品種的耐熱性，從而使鑒定工作簡(jiǎn)化。

表6 不同菜心品種各單項(xiàng)指標(biāo)的灰色關(guān)聯(lián)度分析Table 6 Grey relational degree analysis of every individual indicators in different Chinese cabbage varieties

圖1 不同菜心品種耐熱性聚類圖Fig.1 Dendrogram of clusters in different cultivars of Chinese flowering cabbage

3 討 論

植物耐熱性是由多基因控制的復(fù)雜性狀[21-22]，不同指標(biāo)對(duì)耐熱性的反映并不一致，如果僅用單一的指標(biāo)很難全面準(zhǔn)確地反映各品種的耐熱性強(qiáng)弱，得出結(jié)果可能具有較大偏差；而多項(xiàng)指標(biāo)之間又存在一定的相關(guān)性，容易發(fā)生信息重疊與交叉[6,23]，本研究結(jié)果也證實(shí)這一觀點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)不同作物類型，提出采用多個(gè)指標(biāo)、多種方法相結(jié)合的方式對(duì)作物進(jìn)行抗性鑒定，能更加全面地反映出耐逆性強(qiáng)弱，同時(shí)也篩選出多種與植物耐逆性相關(guān)的生長(zhǎng)和生理生化指標(biāo)[23-25]。本研究選用較為直觀、便捷的21個(gè)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，并將計(jì)算出的各指標(biāo)耐熱系數(shù)作為評(píng)價(jià)菜心單項(xiàng)耐熱能力大小指標(biāo)，以此來(lái)消除不同基因型菜心間固有的生物學(xué)和遺傳學(xué)特性差異。然后采用主成分分析將21個(gè)指標(biāo)的耐熱系數(shù)轉(zhuǎn)換為3個(gè)獨(dú)立的綜合指標(biāo)，通過(guò)隸屬函數(shù)分析法得出各菜心品種綜合耐熱能力(D值)，同時(shí)結(jié)合聚類分析結(jié)果，較為客觀地將20個(gè)參試品種劃分為耐熱型、中等耐熱型和不耐熱型 3個(gè)不同耐熱等級(jí)。最后通過(guò)回歸分析，得出快速鑒別并預(yù)測(cè)菜心耐熱能力的最優(yōu)回歸方程D= -0.767 + 0.861 HDI +0.551 POD + 0.373 MDA + 0.018 SS+ 0.112 GP - 0.014 HP，篩選出6個(gè)對(duì)菜心耐熱能力具有顯著影響的指標(biāo)，即熱害指數(shù)、POD活性、MDA質(zhì)量摩爾濃度、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、發(fā)芽勢(shì)及H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)，這與灰色關(guān)聯(lián)度分析所顯示的各指標(biāo)重要程度的結(jié)果也基本一致。作物耐熱性鑒定的最終結(jié)果是要?jiǎng)澐止┰嚪N質(zhì)的耐熱等級(jí)，以此來(lái)判定其耐熱能力。因此，在相同的高溫脅迫條件下，可通過(guò)測(cè)定這6個(gè)鑒定指標(biāo)，并利用回歸方程來(lái)預(yù)測(cè)候選品種的耐熱性強(qiáng)弱，該方法已在燕麥[26]、棉花[27]和花生[28]等作物的抗逆性鑒定中得到了應(yīng)用。

綜上所述，本試驗(yàn)將參試的20個(gè)菜心品種分成耐熱型( 6個(gè)) 、中等耐熱型( 10個(gè))和不耐熱型(4個(gè)) 3種類型。熱害指數(shù)、POD活性、MDA質(zhì)量摩爾濃度、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、發(fā)芽勢(shì)及H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以作為菜心耐熱性鑒定指標(biāo)。