菲脅迫下蒿柳抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)

李 霞，馬曉東，鄒竣竹，周曉星，孫振元，韓 蕾＊

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院（牡丹學(xué)院），山東 菏澤 274000；3. 岳陽市林業(yè)科學(xué)研究所，湖南 岳陽 414000)

人類的生存環(huán)境離不開地表水體和土壤，然而，由于工業(yè)化進(jìn)程的加速，有害物質(zhì)的種類和數(shù)量急劇增加，破壞生態(tài)平衡，且易通過食物鏈的富集作用危及人類健康。多環(huán)芳烴（PAHs）具有難降解性、毒性（致癌、致突變、致畸效應(yīng)）和生物蓄積性[1-2]，是各國優(yōu)先控制的一類污染物，美國國家環(huán)保局（EPA）將萘、菲、芘、苯并[α]芘等16種PAHs列為優(yōu)先控制污染物[3]。在中國東部109個農(nóng)業(yè)土壤點(diǎn)收集的表層土壤樣本中，PAHs的總濃度從 8.8 到 3 880 μg·kg-1不等[4]。菲是三環(huán)的PAHs類，主要來源于焦化廠、煉油廠等企業(yè)生產(chǎn)的廢水、廢氣及汽車的尾氣排放、垃圾焚燒等，是PAHs的代表，通常在土壤、水體和沉積物中的含量較高。

植物修復(fù)是一種利用根系和地上部分修復(fù)污染土壤和沉積物的低成本修復(fù)技術(shù)，近年來得到了廣泛的研究；但目前植物修復(fù)多環(huán)芳烴的研究多以草本植物為主，而木本植物具有生物量大、根系發(fā)達(dá)及地上部分可多年生長等優(yōu)點(diǎn)。生長較快的洋白蠟（Fraxinus pennsylvanicaMarsh.） 、 DN 34楊（Populus deltoidesMarsh.×P. nigraL. DN 34）和黑柳（Salix nigraMarsh.）相比，黑柳對土壤中PAHs的降解率最高[5]。Hultgren等[6]溫室實(shí)驗(yàn)表明，蒿柳（Salix viminalisL.）種植土壤中菲和芘的降解率分別是沒有植物存在的1.47倍和1.27倍。

植物在修復(fù)PAHs的過程中，應(yīng)能承受由污染物引起的脅迫，但高濃度PAHs對植物具有毒害作用，導(dǎo)致其形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及代謝紊亂[7]，甚至死亡[8]?；钚匝酰≧OS）是逆境下破壞植物防御系統(tǒng)，使細(xì)胞中毒死亡的重要因素，而抗氧化系統(tǒng)（AOS）在活性氧的清除中起重要作用，常被用于植物的抗性評價[9]。關(guān)于植物對PAHs脅迫活性氧生成及抗氧化反應(yīng)的研究有少量報道，如Salehi-Lisar等[10]用芴處理小麥（Triticunt aestivumL.）、紫花苜蓿（Medicago sativaL.）和向日葵（Helianthus annuusL.），認(rèn)為過氧化氫酶（CAT）是植物抵御脅迫的重要酶。Weisman等[11]研究表明，PAHs可誘導(dǎo)擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性增加。Shen等[7]認(rèn)為，類胡蘿卜素和超氧化物歧化酶（SOD）是菲脅迫下參與活性氧清除的最有效的抗氧化劑。這些報道表明了抗氧化系統(tǒng)和PAHs之間的關(guān)系，但關(guān)于木本植物這方面的研究未見報道，而揭示植物膜脂過氧化的原因及關(guān)鍵抗氧化劑的響應(yīng)是提高植物在PAHs污染環(huán)境中抗性的關(guān)鍵。因此，本研究以蒿柳為研究對象，通過前期濃度篩選試驗(yàn)得出其在1.0 mg·L-1菲處理下，植物的生長及根系生理指標(biāo)受到顯著影響，因此，研究該濃度下抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)，為提高木本植物在PAHs脅迫下的抗性及加強(qiáng)修復(fù)效應(yīng)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試植物

選取蒿柳同一無性系、直徑為（1.0±0.2）cm的1年生枝條，在水中剪成10 cm長插條，扦插在灰色塑料箱（容量20 L）內(nèi)，用PVC板支撐并用海綿固定。用自來水培養(yǎng)2周后抹芽，保留1個枝芽，改用1/2 Hoaglang營養(yǎng)液培養(yǎng)，每3 d換1次營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)8周。實(shí)驗(yàn)在玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行，自然光照。

1.2 有機(jī)污染試劑

供試有機(jī)污染物為菲（純度＞97%），其分子量 為 178.238 g·mol-1， 25℃ 純 水 中 溶 解 度 為7.3 μmol·L-1，辛醇-水分配系數(shù)（LogKow）為 4.46。用甲醇（色譜純）做溶劑配制菲的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

將長勢一致的植株移入玻璃容器中適應(yīng)1周后處理。菲標(biāo)準(zhǔn)溶液與蒸餾水配制的改良1/2Hoagland營養(yǎng)液混合，配制成菲濃度為1.0 mg·L-1的處理液，以未加菲的蒸餾水配制的改良1/2 Hoagland營養(yǎng)液為對照，pH值為6.0，處理液中甲醇的濃度為 0.05%。Chapin等[12]報道，甲醇濃度小于0.1%的營養(yǎng)液對植物根系生長沒有影響。每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)15根插條。容器外壁用錫箔紙包裹，保持根系和溶液避光且防止菲的光降解，每2 d更換1次處理液，每4 d隨機(jī)交換容器在溫室中的位置。自然光照，對培養(yǎng)液全程通氧。分別于試驗(yàn)第0、4、8、12、16天采樣，測定葉片的O2·-生成速率、H2O2含量，SOD、過氧化物酶（POD）、CAT、GST、谷胱甘肽還原酶（GR）的活性，還原型谷胱甘肽（GSH）、還原型抗壞血酸（AsA）以及丙二醛（MDA）的含量。

1.4 指標(biāo)測定方法

1.4.1 O2·-生成速率和H2O2的測定及原位染色每個重復(fù)將3棵植株中上部葉片剪碎混勻，放入液氮迅速冷凍并研磨。每個重復(fù)稱取0.1 g，O2·-生成速率的定量測定采用鹽酸羥胺法[13]，H2O2含量的測定參考Brennan等[14]的方法進(jìn)行。原位染色取上部第7～9片成熟葉，用打孔器形成圓形葉盤（直徑1 cm），采用NBT染色法測定O2·-(圖1A)，DAB染色法測定H2O2（圖1B)。

1.4.2 抗氧化物質(zhì)及MDA含量的測定 取樣方法同1.4.1節(jié)。SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑法[15]；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[16]；CAT活性測定采用紫外吸收法[17]；GST活性測定參考Habdous等[18]的方法；GR活性測定采用Parida等[19]的試驗(yàn)方法。GSH含量測定參考Baker等[20]的方法；AsA含量測定參考Foyer等[21]的方法。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[22]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用GraphPad PrismVersion7.0（ GraphPad software， La Jolla，CA，USA）對測定數(shù)據(jù)作圖，并進(jìn)行單因素、雙因素方差分析和多重比較。圖中數(shù)據(jù)均為重復(fù)測定的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 菲脅迫下 O2·－生成速率和 H2O2的變化

圖1表明：O2·-生成速率與H2O2均在菲處理后即大幅度增加。O2·-生成速率在處理后一直極顯著高于對照（p＜0.01），其中，第4天上升最快，為對照的2.42倍，之后有所下降。H2O2在菲處理后第4天和第8天與對照達(dá)極顯著差異（p＜0.01），分別為對照的1.95倍和1.92倍，之后呈下降趨勢，處理第16天時與對照相比無顯著差異（p＞0.05）。

圖 1 菲處理下蒿柳活性氧的動態(tài)變化Fig. 1 Changes of ROS contents under phenanthrene treatment

2.2 菲脅迫下SOD、POD和CAT活性的變化

圖2 表明：菲脅迫下，SOD、POD和CAT活性均升高。與對照相比，SOD活性和POD活性均在處理第8天出現(xiàn)顯著變化（p＜0.05），分別為對照的1.32和1.23倍，之后 SOD的變化不大，POD一直升高，第16天時達(dá)到最高，為對照的2.03倍。CAT在處理第4天迅速升高，為對照的2.69倍，之后出現(xiàn)下降，但與對照相比一直呈顯著（p＜0.05）或極顯著差異（p＜0.01）。

圖 2 菲處理下蒿柳SOD、POD、CAT活性的變化Fig. 2 Changes of SOD、POD、CAT activity under phenanthrene treatment

2.3 菲脅迫下GST和GR活性的變化

圖3 表明：菲處理后，GST和GR活性均上升；GST活性在處理第4天和第8天與對照相比差異不顯著，第12～16天迅速上升，第16天時為對照的1.94倍，差異極顯著（p＜0.01）。GR活性在處理后即迅速上升，與對照相比呈極顯著差異（p＜0.01），第16天為對照的2.24倍。

2.4 菲脅迫下GSH和AsA含量的變化

圖4表明：菲處理后，GSH含量迅速升高，且一直處于較高水平，與對照相比呈極顯著差異（p＜0.01），最大為對照的2.43倍。AsA的含量處理后即低于對照，第4天時為對照的60.6%，但隨著脅迫時間的延長呈上升趨勢，第16天時高于對照（p＜0.01），為對照的1.23倍。

圖 3 菲處理下蒿柳GST和GR活性的變化Fig. 3 Changes of GST and GR activity under phenanthrene treatment

圖 4 菲處理下蒿柳GSH和AsA含量的變化Fig. 4 Changes of GSH and AsA contents under phenanthrene treatment

2.5 菲脅迫下MDA含量的變化

圖5 表明：菲脅迫下，MDA含量一直高于對照，第8天上升最快，與對照相比差異極顯著（p＜0.01），為對照的1.24倍，第16天時有所下降，為對照的1.14倍。

圖 5 菲處理下蒿柳MDA含量的變化Fig. 5 Changes of MDA contents under phenanthrene treatment

3 討論

3.1 菲脅迫下活性氧的動態(tài)變化

植物遭受脅迫后往往體內(nèi)活性氧增加，主要包括 O2·-、 H2O2、 單 線 態(tài) 氧 （1O2） 和 羥 自 由 基（·OH）。O2·-和H2O2能直接氧化細(xì)胞內(nèi)的許多組分，破壞生物大分子，造成膜脂過氧化。本試驗(yàn)中，O2·-生成速率在菲處理后一直高于對照，這是因?yàn)镻AHs被植物吸收后首先在體內(nèi)發(fā)生羥基化反應(yīng)，單加氧酶（如細(xì)胞色素P-450）可使單環(huán)和PAHs轉(zhuǎn)化為羥基化合物，在此過程中可能把電子漏給O2形成O2·-，或者在無氧條件下發(fā)生氧化還原反應(yīng)形成超氧化物和過氧化物[23-24]。隨著處理時間的延長，O2·-生成速率的增加量有所下降，這與SOD活性的升高有關(guān)，SOD歧化O2·-生成H2O2，但SOD的升高不足以清除產(chǎn)生的O2·-，因此，O2·-一直高于對照。菲處理后H2O2含量迅速升高，之后一直下降，最后與對照無顯著差異，這說明CAT和POD活性的上升可以清除多余的H2O2。較高濃度的H2O2可以在過氧化物酶體和乙醇酸循環(huán)中被CAT催化轉(zhuǎn)化為O2和H2O，而在不含CAT的葉綠體、細(xì)胞質(zhì)及含CAT很少的線粒體中，H2O2又在POD的催化下反應(yīng)生成O2和H2O[25]。

3.2 菲脅迫下抗氧化物質(zhì)的動態(tài)變化

誘導(dǎo)植物氧化應(yīng)激是PAHs已知的效應(yīng)[26]，研究表明，抗氧化酶對PAHs有不同的響應(yīng)，依據(jù)植物種類和PAHs的濃度而不同。擬南芥在0、0.25、0.5 mmol·L-1菲處理下，CAT活性無顯著變化，SOD和POD活性上升[27]。在熒蒽處理下，擬南芥隨熒蒽濃度的升高葉片SOD活性提高，GSH、H2O2和MDA含量均有不同程度的增加[28]。本試驗(yàn)中，3種酶活性在菲處理后都升高，對于緩解氧化脅迫起重要作用。SOD以O(shè)2·-為底物，將其歧化為H2O2。CAT可直接清除H2O2，是早期反應(yīng)的重要保護(hù)酶。POD則有不同的反應(yīng)機(jī)制，Chroma等[29]研究得出，POD和細(xì)胞色素P450這2種酶系統(tǒng)在植物體內(nèi)對外源物質(zhì)多氯聯(lián)苯（PCBs）和PAHs的解毒機(jī)制中都有部分參與。本研究中，POD與H2O2成顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05），POD可能利用H2O2氧化菲或其代謝中間產(chǎn)物，使其變成低毒或無毒的物質(zhì)，這與Gao等[30]的研究結(jié)果一致。

GSH和AsA是植物體內(nèi)重要的抗氧化劑。本試驗(yàn)中，菲處理后GSH含量迅速上升，GR的活性上升使蒿柳保持較高的GSH含量。GSH除清除活性氧外以外，對有毒的外來化合物具有解毒作用，是植物防御系統(tǒng)的重要組成部分[31]。GST專一催化GSH的巰基與其它化合物的親電基團(tuán)作用，生成谷胱甘肽衍生物[32]。本試驗(yàn)中，菲誘導(dǎo)了GST活性上升，且在第16天時達(dá)到對照的2.1倍，說明隨著菲向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)增多，經(jīng)細(xì)胞色素第一步代謝后，代謝生成的羥基化合物等中間產(chǎn)物可以在GST的催化下與GSH結(jié)合，從而達(dá)到解毒的目的。AsA含量與對照相比降低，Caviglia等[33]也報道了類似的結(jié)果，長期（2周和4周）施用除草劑百草枯后，植物組織中的抗氧化劑濃度顯著降低，植物組織產(chǎn)生大量草酸鈣，草酸鈣的前體是抗壞血酸。這是因?yàn)橹参锝M織中的AsA可以被在細(xì)胞中積累的H2O2迅速轉(zhuǎn)化。Wieczorek等[34]把蒽和苯并[k]熒蒽噴灑在芹菜葉片上，導(dǎo)致AsA含量降低，總酸含量升高，可以間接證明這種轉(zhuǎn)化。本研究在處理過程中，雖然AsA低于對照，但一直呈上升趨勢，而H2O2的含量一直下降，間接證明了這種相關(guān)性。

3.3 菲脅迫下MDA的動態(tài)變化

MDA含量是活性氧積累和脂質(zhì)過氧化的生物標(biāo)志物[35]，通常用于說明植物對氧化應(yīng)激的敏感性[36]。植物中PAHs毒性引起的MDA積累在擬南芥和菜心（Brassica campestrisvar.campestrisL.）中已有報道[27,37]。本研究中，MDA在脅迫過程中一開始上升，后呈下降趨勢，這與Salehi-Lisar等[10]用芴處理下盆栽小麥、紫花苜蓿和向日葵的研究結(jié)果一致。這是由于蒿柳在一開始產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，應(yīng)激條件下的代謝失衡導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，活性氧作為信號分子被傳導(dǎo)到植物體內(nèi)，觸發(fā)抗氧化系統(tǒng)的防御機(jī)制，從而達(dá)到適應(yīng)環(huán)境的目的，從而緩解應(yīng)激條件[36,38]。

4 結(jié)論

PAHs是一種能誘導(dǎo)蒿柳葉片細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的污染物。菲處理下，首先，O2·-和H2O2大量增加，MDA含量升高，蒿柳表現(xiàn)出積極的防御措施，表現(xiàn)為抗氧化酶和抗氧化劑的上升；SOD活性升高，但不足以清除多余的 O2·-，O2·-是造成細(xì)胞膜脂過氧化的主要活性氧；CAT與POD的升高可以清除菲脅迫下產(chǎn)生的過量H2O2，對于緩解氧化脅迫起重要作用，其中，CAT是蒿柳早期響應(yīng)的重要標(biāo)志物；抗氧化劑中，GSH對PAHs的反應(yīng)最敏感，GSH是蒿柳應(yīng)對菲脅迫的重要抗氧化劑，并通過GST的催化對植物體內(nèi)菲的代謝中間產(chǎn)物進(jìn)行解毒。