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    黃地安消膠囊對糖尿病認(rèn)知功能障礙大鼠神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究

    2020-04-21 14:11:52宣瑋婷高華武方朝暉
    關(guān)鍵詞:奈哌神經(jīng)細(xì)胞海馬

    宣瑋婷,蔡 標(biāo),葉 婷,高華武,方朝暉,葉 樹,3,王 艷,汪 瀚

    (1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230031;3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所,安徽 合肥 230012;4.安徽省中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230012)

    糖尿病認(rèn)知功能障礙(diabetic cognitive dysfunction,DCD)是2型糖尿病(type 2 diabetes melllitus,T2DM)一種嚴(yán)重的并發(fā)癥,慢性高血糖和高脂血癥是引起DCD的主要誘因[1-3]。慢性高血糖可觸發(fā)神經(jīng)損傷和內(nèi)皮功能障礙,導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生[4-7]。慢性高血糖癥可促進(jìn)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)沉積,增加神經(jīng)細(xì)胞的敏感性,從而對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生Aβ神經(jīng)毒性[8]。Aβ沉積是癡呆發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵,也是導(dǎo)致其他病理改變的起始環(huán)節(jié)[9]。因此,改善高血糖及清除Aβ沉積,能有效治療糖尿病引起的認(rèn)知功能障礙。此外,高血糖刺激會加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步加重T2DM患者神經(jīng)細(xì)胞損傷,使突觸結(jié)構(gòu)和功能受損,進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶能力[10-11]。

    黃地安消膠囊由黃連、生地黃、麥冬、葛根、枇杷葉、三七組成,具有清熱解毒、益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之效,同時具有降低血糖、血脂和腦保護(hù)作用[12]。然而,黃地安消膠囊治療DCD的作用機(jī)制還不明確。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)聯(lián)合雙側(cè)海馬注射Aβ25-35建立DCD大鼠模型[13],期間給予不同劑量黃地安消膠囊,觀察黃地安消膠囊對DCD海馬神經(jīng)細(xì)胞的影響,以凋亡信號Bax/Bcl-2為靶點(diǎn)探究其機(jī)制,為臨床治療DCD提供新方法。

    1 材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF級9周齡雄性SD大鼠70只,體質(zhì)量為220~250 g,購自浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心[生產(chǎn)許可證號為SCXK(浙)2014-0001],實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 黃地安消膠囊(批號20150921):由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供;多奈哌齊(批號1604044):衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司;二甲雙胍(批號AAZ5285):美國Merck Serono公司。

    1.3 試劑與儀器 Aβ25-35、STZ:美國Sigma公司;Bcl-2、Bax兔抗大鼠抗體:Bioworld公司;Trizol試劑:美國Ambion公司;cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒:美國Thermo scientific公司;SYBR染料:日本TOYOBO公司;腦立體定位儀:美國Stoelting公司;RM2016病理切片機(jī):上海徠卡儀器有限公司;GA3型血糖儀及試紙:中國三諾生物傳感股份有限公司;042B R12088電泳儀:美國Bio-Rad公司;K3型酶標(biāo)儀:美國Thermo Fisher Scientific公司;FCM凝膠成像儀:美國 Protein Simple公司;7500 Real-time PCR儀:美國Applied Biosystems公司;Eclipse E100光學(xué)顯微鏡:日本尼康公司。

    2 方法

    2.1 動物分組 將大鼠隨機(jī)分為7組:正常組、模型組、黃地安消高劑量組(12 g/kg,相當(dāng)于臨床等效量8倍)、黃地安消中劑量組(6 g/kg,相當(dāng)于臨床等效量4倍)、黃地安消低劑量組(3 g/kg,相當(dāng)于臨床等效量2倍)、二甲雙胍組(540 mg/kg,相當(dāng)于臨床等效量3倍)、多奈哌齊組(1.4 mg/kg,相當(dāng)于臨床等效量3倍),每組10只。

    2.2 大鼠模型復(fù)制[13]除正常組外,其余6組大鼠予高脂飼料(飼料配方:70%常規(guī)飼料,10%豬油,5%蛋黃粉,0.5%膽固醇,10%蔗糖)喂養(yǎng),喂養(yǎng)周期為4周。各組大鼠于第4周末進(jìn)行模型復(fù)制,在模型復(fù)制前1天17:00開始禁食不禁水,第2天9:00一次性腹腔注射STZ溶液(35 mg/kg),STZ腹腔注射后72 h即檢測空腹血糖,高于11.1 mmol/L進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。經(jīng)10%水合氯醛(380 mg/kg)腹腔注射麻醉后,將大鼠固定在腦立體定位儀上,用微量注射泵分別將10 μL(5 μg)Aβ25-35緩慢注入雙側(cè)海馬(以前囟為原點(diǎn),向后4.4 mm、旁開2.2 mm為穿刺點(diǎn),自腦表面進(jìn)針3.0 mm)。以學(xué)習(xí)記憶減退、神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)損傷及海馬CA1區(qū)Aβ沉積增多為模型復(fù)制成功的標(biāo)志。各組注射Aβ25-35前1周開始灌胃給予相應(yīng)藥物,連續(xù)28 d。正常組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),不予任何處理。

    2.3 Morris水迷宮法檢測大鼠逃避潛伏期 給藥第23天開始進(jìn)行訓(xùn)練,前4天常規(guī)訓(xùn)練,每日1次,分別從水迷宮的4個象限將大鼠背對隱藏在水面下的平臺放入水中,記錄大鼠90 s尋找到水下平臺所需時間,為逃避潛伏期。若大鼠找不到平臺,將其引至平臺,記錄逃避潛伏期為90 s。第5天,測試大鼠從第3象限找到平臺的時間,為最終數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)的采集和處理由Morris水迷宮圖像自動監(jiān)視處理系統(tǒng)完成。

    2.4 檢測空腹血糖變化 分別于模型復(fù)制前、模型復(fù)制后及給藥后,各組大鼠尾靜脈無菌操作后用采血針取血,用血糖儀測定各組大鼠禁食12 h的空腹血糖。

    2.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷情況 將固定的腦組織包埋,切片厚度為5 μm,行常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷情況并拍照。

    2.6 免疫熒光法檢測大鼠海馬中Aβ沉積 “2.3”“2.4”“2.5”實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃地安消中劑量組具有最好的藥效,故進(jìn)行機(jī)制探討時選擇黃地安消中劑量組進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。PBS沖洗3次,每次5 min;加入BSA孵育30 min;加入Aβ抗體孵育24 h;洗滌后,加入二抗孵育50 min;PBS洗滌后,加入DAPI孵育50 min;沖洗并蓋上抗熒光淬滅劑封片;采用熒光顯微鏡采集圖像,用IPP 6.0軟件進(jìn)行計算。

    2.7 Western blot法檢測海馬組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平 經(jīng)提取海馬組織總蛋白,分離總蛋白,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入一抗Bcl-2、Bax,加入二抗IgG,加入ECL試劑,曝光并拍照,凝膠圖像處理系統(tǒng)分析灰度值。β-actin作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.8 熒光定量PCR法檢測海馬組織中Bcl-2、Bax mRNA的含量 采用Trizol法提取海馬總mRNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用7500 Real-time PCR儀檢測,反應(yīng)條件包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng),每個樣本重復(fù)3個孔。本研究所用的引物序列:

    Bax:上游5′- CCAGGACGCATCCACCAAG AAG-3′,下游5′- GCTGCCACACGGAAGAAGAC C-3′;

    Bcl-2:上游5′-ACGGTGGTGGAGGAACTCT TCAG-3′,下游5′-GTGCAGATGCCGGTTCAG GTAC-3′;

    β-actin:上游5′-TTGATTTGGCTGGTAGA A-3′,下游5′-ATGGCAGAAGATTGAGAA-3′。 采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)水平。

    3 結(jié)果

    3.1 各組大鼠逃避潛伏期比較 與正常組比較,模型組大鼠逃避潛伏期顯著增加(P<0.05);與模型組比較,黃地安消高、中劑量組,二甲雙胍及多奈哌齊組逃避潛伏期均減少(P<0.05)。見表1。

    表1 各組大鼠逃避潛伏期比較

    注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

    3.2 各組大鼠空腹血糖水平比較 模型復(fù)制前各組大鼠空腹血糖比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);模型復(fù)制后,與正常組比較,模型組大鼠空腹血糖明顯升高(P<0.05);給藥28 d后,與模型組比較,黃地安消高、中劑量組,二甲雙胍組及多奈哌齊組大鼠空腹血糖水平均降低(P<0.05)。見圖1。

    注:A.正常組;B.模型組;C.黃地安消高劑量組;D.黃地安消中劑量組;E.黃地安消低劑量組;F.二甲雙胍組;G.多奈哌齊組;與正常組比較,*P#P<0.05

    3.3 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷情況比較 正常組細(xì)胞排列緊密,神經(jīng)細(xì)胞和細(xì)胞核形態(tài)完整。模型組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,細(xì)胞間隙變大,數(shù)量減少,多見體積縮小、胞核固縮伴有破裂的死亡的神經(jīng)細(xì)胞。黃地安消中劑量組、二甲雙胍組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列較緊密,染色均勻,神經(jīng)細(xì)胞損傷較少。黃地安消高、低劑量組大鼠海馬有部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)損傷,多奈哌齊組大鼠海馬可見部分損傷的神經(jīng)細(xì)胞。見圖2。

    注:A.正常組;B.模型組;C.黃地安消高劑量組;D.黃地安消中劑量組;E.黃地安消低劑量組;F.二甲雙胍組;G.多奈哌齊組;箭頭所示處為海馬神經(jīng)細(xì)胞

    圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞組織學(xué)變化(HE染色,10×40倍)

    3.4 各組大鼠海馬Aβ沉積情況 正常組大鼠海馬CA1區(qū)Aβ沉積較少,模型組大鼠海馬CA1區(qū)發(fā)現(xiàn)大量Aβ沉積,而黃地安消膠囊中劑量組、二甲雙胍和多奈哌齊組大鼠海馬CA1區(qū)Aβ沉積較少。見圖3。

    3.5 各組大鼠海馬組織中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較,模型組Bax蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯減少(P<0.05);與模型組比較,黃地安消中劑量組、二甲雙胍組、多奈哌齊組Bax蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。見圖4。

    3.6 各組大鼠海馬組織中Bax、Bcl-2 mRNA含量比較 與正常組比較,模型組海馬組織中Bax mRNA含量明顯增加(P<0.05),Bcl-2 mRNA含量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,黃地安消中劑量組、二甲雙胍組、多奈哌齊組Bax mRNA含量均明顯降低(P<0.05),Bcl-2 mRNA含量均明顯升高(P<0.05)。見圖5。

    4 討論

    認(rèn)知功能下降和T2DM關(guān)系密切。研究[14-15]表明,糖尿病影響神經(jīng)系統(tǒng)。高血糖被認(rèn)為是糖尿病患者認(rèn)知能力下降的一個決定性原因,因此,控制血糖對改善糖尿病引起的認(rèn)知功能障礙是很有必要的[4]。此外,有研究[16]證實(shí),海馬細(xì)胞凋亡是引起海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少,海馬萎縮,繼而引起認(rèn)知功能障礙的重要原因之一。因此,高血糖引起的Aβ沉積導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙是本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究對象。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射STZ溶液聯(lián)合Aβ25-35雙側(cè)海馬注射進(jìn)行模型復(fù)制后,模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降,空腹血糖水平升高,海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)損傷,Aβ沉積增加,表明本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制DCD動物模型。

    注:A.正常組;B.模型組;D.黃地安消中劑量組;F.二甲雙胍組;G.多奈哌齊組;箭頭所示處為Aβ沉積處

    圖3 各組大鼠海馬Aβ沉積情況(DAPI染色, 10×40倍)

    注:A.正常組;B.模型組;D.黃地安消中劑量組;F.二甲雙胍組;G.多奈哌齊組;與正常組比較,*P#P<0.05

    注:A.正常組;B.模型組;D.黃地安消中劑量組;F.二甲雙胍組;G.多奈哌齊組;與正常組比較,*P#P<0.05

    黃地安消膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑,以黃連清熱燥濕、瀉火解毒,清解肺胃之燥熱;生地黃清熱生津、滋陰養(yǎng)血,養(yǎng)心、腎之陰;葛根解肌退熱、生津止渴,清退肺胃之熱;麥冬養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除煩;枇杷葉清降肺胃之氣;三七化瘀止血;全方共奏清熱解毒、養(yǎng)陰生津、活血通絡(luò)之功效。黃地安消膠囊能夠改善胰島素抵抗,保護(hù)胰島β細(xì)胞功能,降低血糖。本研究顯示,黃地安消膠囊可明顯改善DCD動物模型學(xué)習(xí)記憶能力,減少海馬神經(jīng)損傷,降低空腹血糖,減少Aβ沉積。

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在T2DM的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用,其啟動的凋亡途徑是近幾年來新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡途徑[17]。Bcl-2和Bax為Bcl-2家族的兩個成員,共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡過程。其中Bax是一種促凋亡蛋白,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白,抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)Bcl-2表達(dá)較多時,與Bax形成異源二聚體,減緩細(xì)胞凋亡;當(dāng)Bax表達(dá)增多時,形成大量Bax同源二聚體,誘發(fā)細(xì)胞凋亡[18-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組大鼠Bax蛋白表達(dá)量及mRNA含量均明顯升高,而Bcl-2蛋白表達(dá)量及mRNA含量均明顯降低。經(jīng)黃地安消膠囊治療后,模型組Bax蛋白表達(dá)量及mRNA含量均明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)量及mRNA含量均明顯升高。

    本次研究結(jié)果表明,黃地安消膠囊可通過降低血糖,保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞及清除Aβ沉積來改善認(rèn)知功能障礙,調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2凋亡信號通路可能是其潛在的作用機(jī)制。

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