艾灸對去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路的影響

姚長風(fēng)，劉自兵，唐 巍，張 燕，劉存斌，汪宗寶，李斯亮

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，安徽 合肥 230012)

骨代謝性疾病是臨床常見疾病，其中以骨質(zhì)疏松癥的危害性最大。在我國中老年人群中，骨質(zhì)疏松癥女性患者多見。艾灸等中醫(yī)藥療法是目前臨床治療骨質(zhì)疏松癥的較好方法[1-2]，且不良反應(yīng)不明顯，因而日益受到人們的重視。既往研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，艾灸關(guān)元、三陰交可以有效提高去卵巢大鼠的骨密度，提高血清中雌二醇含量，亦可以有效提高女性患者血清中雌二醇含量，但其內(nèi)在機制尚未明確。不少學(xué)者指出，骨改建的失衡是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的根本原因，作為成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)在改建過程中具有重要作用。有學(xué)者認(rèn)為，Wnt/β-catenin信號通路是BMMSCs分化為成骨細(xì)胞過程中的重要信號通路。因而本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，以經(jīng)典的去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥模型為研究對象，利用現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)，觀察艾灸三陰交、關(guān)元穴對去卵巢大鼠BMMSCs中Wnt/β-catenin信號通路的影響，探究艾灸影響骨代謝的內(nèi)在機制。

1 材料

1.1 實驗動物 6月齡SPF級SD雌性大鼠60只，體質(zhì)量(310±10)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-0002]提供。

1.2 主要試劑及儀器 MTT(BS0328)：北京綠生源科技有限公司；骨鈣素(bone glaprotein,BGP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(20160110、20160108)：上海源葉生物科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(PIKOREAL 96)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(00287813)：Thermo；β-連環(huán)蛋白(β-catenin)(GR177612-31)：Abcam；TCF-4(7)：CST；一抗Wnt3a(150604)、Dkk1(AF02158945)：Bioss。

2 方法

2.1 動物模型復(fù)制、分組和干預(yù) 采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠隨機分為正常組(20只)和去卵巢組(40只)。在切除大鼠卵巢第13周時，從正常組和去卵巢組各取10只，按照文獻[3]方法鑒定骨質(zhì)疏松癥模型。將去卵巢組再隨機分成正常組、模型組、雌二醇組和艾灸組，每組10只。實驗過程中對動物的處置符合2006年國家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

艾灸組大鼠取三陰交、關(guān)元穴(參照《實驗針灸學(xué)》中“大鼠常見穴位圖譜”[5]進行穴位定位)，以0.75 cm×30 cm艾條在距穴位皮膚1 cm處進行溫和灸，每穴灸15 min，每日1次。雌二醇組給予17β-雌二醇100 μg/(kg·d)灌胃，每日1次。模型組和正常組給予2 mL 9.0 g/L氯化鈉注射液灌胃，每日1次。6次為1個療程，療程間休息1 d，共12個療程。

2.2 標(biāo)本采集 對去卵巢的各組大鼠分別干預(yù)12周后處死，在無菌操作下分離股骨和脛骨，剔凈周圍軟組織，剪除兩端骨組織，暴露骨髓腔，用2 mL射器，從一端緩慢注入含10%胎牛血清、100 U/mL青-鏈霉素的高糖ɑ-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基，將沖出的骨髓細(xì)胞，用含10%胎牛血清的ɑ-MEM培養(yǎng)基置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液1次，待用。

2.3 MTT法檢測大鼠BMMSCs的活性 取F2代細(xì)胞，制成每孔1×103個的細(xì)胞懸液，接種到96孔板，設(shè)5組，每組3個復(fù)孔，每孔細(xì)胞懸液200 μL，置37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱內(nèi)孵育，每間隔4 d取1組，每孔加入MTT(2 mg/mL)20 μL，37 ℃孵育，4 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(分析純)，移至酶聯(lián)免疫檢測儀上振蕩10 min，用分光光度計在492 nm波長處測定每孔的光密度(optical density, OD)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線，培養(yǎng)第4、8、12、16天時，分別檢測各組大鼠BMMSCs的相對增長率，以相對增長率反映BMMSCs的活性。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠BMMSCs中BGP含量 ①收集細(xì)胞上清液后，3 000 r/min離心10 min，去除顆粒和聚合物。②設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。③樣本孔先加入待測樣本血清10 μL，再加入樣本稀釋液40 μL，空白孔不加血清，僅加入稀釋液50 μL。④除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。⑤棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復(fù)洗板5次。⑥每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。⑦每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的OD值。測定各組大鼠BMMSCs中BGP含量。

2.5 實時熒光定量PCR法測定Wnt3a、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-5(low density lipoprotein receptor associated protein-5，LRP-5)、LRP-6、Dkk1、β-catenin和T細(xì)胞因子(T-cell factor, TCF) mRNA相對表達水平 將每組F2代BMMSCs移至六孔板內(nèi)，每孔1×105個，用2 mL含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的ɑ-MEM培養(yǎng)細(xì)胞。3 d后，孔內(nèi)細(xì)胞濃度達80%時，吸盡培養(yǎng)液，PBS洗2次，采用一步法抽提mRNA，檢驗其質(zhì)量和完整性。逆轉(zhuǎn)錄后，采用實時熒光定量PCR法測定Wnt3a、LRP-5、LRP-6、Dkk1、β-catenin和TCF mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。引物由Invitrogen公司合成，每組每個樣品設(shè)立6個復(fù)孔，取均值，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達水平。

表1 Wnt3a、LRP-5、LRP-6、Dkk1、β-catenin、TCF mRNA的引物序列

2.6 Western blot法測定Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白的表達水平 按“2.5”項下方法培養(yǎng)BMMSCs，加入100 μL蛋白裂解液[V(PMSF)∶V(RIPA)=1∶100]，冰上靜止20 min，收集裂解的細(xì)胞，12 000 r/min離心15 min，收集上清后，采用Western blot法測定Wnt3a、Dkk1、β-catenin和TCF蛋白的表達水平。

3 結(jié)果

3.1 不同時點4組大鼠BMMSCs活性比較 隨著培養(yǎng)時間延長，除了模型組外，其他3組大鼠BMMSCs相對增長率顯著升高，各時點差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在培養(yǎng)第4、8、12、16天，模型組大鼠BMMSCs相對增長率均顯著低于正常組(P<0.05)，雌二醇組大鼠BMMSCs相對增長率均顯著高于模型組和艾灸組(P<0.05)；在培養(yǎng)第12、16天，艾灸組大鼠BMMSCs相對增長率顯著高于模型組(P<0.05)。見圖1。

注：與正常組比較，*P#P△PaPbPcP

3.2 4組大鼠BMMSCs中BGP含量比較 模型組大鼠BMMSCs中BGP含量顯著低于正常組(P<0.05)，雌二醇組和艾灸組大鼠BMMSCs中BGP含量顯著高于模型組(P<0.05)。見圖2。

注：與正常組比較，*P#P<0.05

3.3 4組大鼠BMMSCs中Wnt3a、LRP-5、LRP-6、Dkk1、β-catenin、TCF mRNA相對表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠BMMSCs中Wnt3a、LRP-5、LRP-6、β-catenin、TCF mRNA相對表達水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，Dkk1 mRNA相對表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組Wnt3a、LRP-5、LRP-6、β-catenin、TCF mRNA相對表達水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，Dkk1 mRNA相對表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)；與雌二醇組比較，艾灸組Wnt3a、LRP-5、LRP-6、β-catenin、TCF mRNA相對表達水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，Dkk1 mRNA相對表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠BMMSCs中Wnt3a、LRP-5、LRP-6、Dkk1、β-catenin、TCF mRNA相對表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與雌二醇組比較，△P<0.05

3.4 4組大鼠BMMSCs中Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白相對表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠BMMSCs中Wnt3a、β-catenin、TCF蛋白的相對表達水平顯著下調(diào)，Dkk1蛋白的相對表達水平顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組和雌二醇組Wnt3a、β-catenin、TCF蛋白的相對表達水平顯著上調(diào)，Dkk1蛋白的相對表達水平顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與雌二醇組比較，艾灸組Wnt3a、β-catenin蛋白的相對表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)，TCF蛋白的相對表達水平下調(diào)(P>0.05)，Dkk1蛋白的相對表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖3、表3。

4 討論

近年來的研究表明，BMMSCs在骨折愈合、骨質(zhì)疏松癥的治療中發(fā)揮了重要的作用[6-7]。黃建華等[8]認(rèn)為腎中所藏的先天之精主要相應(yīng)于機體的胚胎干細(xì)胞及其他存在于各種人體組織器官中的成體干細(xì)胞，通常情況下，這些體內(nèi)的干細(xì)胞是處于正常休眠的狀態(tài)，當(dāng)受到外界刺激時，可激活、分化成機體各組織器官內(nèi)在環(huán)境中所需要的細(xì)胞[9-10]。本次研究發(fā)現(xiàn)，艾灸三陰交、關(guān)元穴可增強BMMSCs的活性，使BGP水平升高。我們的既往研究也發(fā)現(xiàn)，針灸此兩穴可調(diào)節(jié)雌激素水平，增強骨密度[4,11]。

圖3 Western blot法檢測的4組大鼠BMMSCs中Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白相對表達水平

表3 4組大鼠BMMSCs中Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白相對表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與雌二醇組比較，△P<0.05

結(jié)合本研究結(jié)果，說明骨密度的增加可能與針灸后BMMSCs的成骨分化作用增加有關(guān)。本研究選用的艾灸穴為關(guān)元、三陰交，均居治療骨質(zhì)疏松癥常用穴位的前10位[12]，分屬任脈和脾經(jīng)，具有健脾益氣、調(diào)肝補腎作用[13]和強身健體、補腎壯陽、調(diào)理沖任、理氣和血作用[14]。更有研究者證實艾灸可提高骨密度[15]。因艾灸時可“以之艾火，透諸經(jīng)而除百病”(《本草從新》)，與中醫(yī)藥的其他治療方法一樣，其可通過艾灸特定的經(jīng)穴，達到一定的臨床效應(yīng)。

艾灸關(guān)元、三陰交穴提高骨密度的內(nèi)在機制可能與其干預(yù)大鼠BMMSCs的Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。Wnt/β-catenin通路是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一條經(jīng)典通路，也是與骨代謝關(guān)系密切的一個重要信號通路。當(dāng)其激活時，Wnt3與跨膜蛋白LRP-5/6以及卷曲蛋白受體結(jié)合，抑制糖原合成酶激酶-3β磷酸化β-catenin，使β-catenin在細(xì)胞內(nèi)蓄積。本研究發(fā)現(xiàn)，艾灸組相較于模型組，其大鼠BMMSCs中Wnt3a、LRP-5、LRP-6、β-catenin mRNA的表達均上調(diào)，且Wnt3a、β-catenin蛋白的表達水平亦升高。結(jié)果提示通過艾灸關(guān)元、三陰交穴可能激活BMMSCs的Wnt/β-catenin信號通路，阻止GSK3β對β-catenin的降解，使胞質(zhì)內(nèi)β-catenin蓄積，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，與TCF/淋巴樣增強子1結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[16],從而促使BMMSCs向成骨細(xì)胞分化加強[17]。本研究也證實，在此信號激活轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中細(xì)胞核內(nèi)TCF mRNA及其蛋白的表達均明顯上調(diào)。

Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中還有一些重要的負(fù)向調(diào)節(jié)因子[18]。Dkk1是常見的3個負(fù)向調(diào)節(jié)因子之一，是一種分泌性糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)Dkk1能與LRP5/6、跨膜受體Kremen 1/2結(jié)合形成三聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞，減少LRP5/6在細(xì)胞膜上的表達，從而阻斷Wnt信號繼續(xù)向胞內(nèi)傳遞[19]。有學(xué)者認(rèn)為，Dkk1在骨形成過程中起著重要作用，是骨質(zhì)疏松、骨修復(fù)的治療靶點[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，艾灸關(guān)元穴、三陰交穴后，相較于模型組，雌二醇組和艾灸組大鼠BMMSCs的Dkk1 mRNA和蛋白表達皆下調(diào)。因此，我們推測在該信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，艾灸關(guān)元、三陰交穴可能抑制了Dkk1 mRNA及其蛋白的表達，促使Wnt更易于與LRP5/6蛋白結(jié)合，從而激活Wnt信號通路，增強BMMSCs的成骨分化功能，有助于骨形成。許多研究也表明，阻斷Dkk1的功能有利于骨形成和防止系統(tǒng)性骨量丟失[21]。

本研究結(jié)果提示，艾灸關(guān)元、三陰交可以增強大鼠BMMSCs的活性，提高BGP水平，激活Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制通路中負(fù)向調(diào)節(jié)因子Dkk1的表達，從而使BMMSCs的成骨分化功能增強，恢復(fù)骨代謝平衡。本研究揭示了艾灸防治骨質(zhì)疏松癥的內(nèi)在機制，有助于尋找新的、有效的，能夠代替激素治療骨質(zhì)疏松癥的方法。下一步將觀察艾灸頻次、艾灸量和艾灸時間對骨質(zhì)疏松癥的影響，進一步探究艾灸激活Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中“決定性”的信號靶點。