不同穴位艾灸對腹瀉模型小鼠腹瀉指數(shù)及小腸AQP8、VIP及SP表達(dá)的影響

楊曉希，武小利，高 紡，吳生兵，周美啟

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800)

腹瀉是指日排便超過3次且每日排便量大于200 g，糞便內(nèi)含水量高于85%[1]。功能性腹瀉是腹瀉的一種，是較為常見的消化道疾病，其發(fā)病一般無器質(zhì)性損害，多數(shù)原因可能與患者飲食習(xí)慣、生活起居以及個(gè)人體質(zhì)因素相關(guān)，因此其發(fā)病率一直居高不下。目前，隨著艾灸在臨床上的廣泛使用，艾灸治療功能性腹瀉的療效也十分顯著，并逐漸得到大眾的認(rèn)可[2-5]。因此，艾灸治療腹瀉也成為目前的研究熱點(diǎn)[6]。研究[7]表明，針灸治療功能性腸病是通過神經(jīng)-免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控途徑發(fā)揮作用，但艾灸干預(yù)功能性腹瀉是否通過調(diào)節(jié)血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、P物質(zhì)(substance P，SP)和水通道蛋白8(aquaporin protein-8，AQP8)表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的暫不得而知。本研究在前期研究[8]基礎(chǔ)上，觀察艾灸對腹瀉模型小鼠腹瀉指數(shù)及小腸組織VIP、SP、AQP8表達(dá)的影響，探討艾灸干預(yù)腹瀉的作用機(jī)制，為艾灸臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物及分組 選取健康、清潔級昆明小鼠90只，雄性，體質(zhì)量為20～30 g，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-0002。獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度控制在(22±1)℃的范圍內(nèi)，相對濕度(55±5)%，自然光照，小鼠自取食水。室溫適應(yīng)環(huán)境下飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法，從90只小鼠中選取15只作為正常組，其余75只進(jìn)行腹瀉模型的復(fù)制，將模型復(fù)制成功的小鼠隨機(jī)分為天樞組、大腸俞組、天樞大腸俞組和模型組，每組16只。模型復(fù)制不成功的以及實(shí)驗(yàn)中死亡小鼠均未列入實(shí)驗(yàn)分析對象。

1.2 藥品與試劑 番瀉葉：合肥百姓緣大藥房；中性甲醛、乙醇、二甲苯：上?；瘜W(xué)試劑公司；AQP8、VIP、SP抗體及通用型二步法二抗、DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其余實(shí)驗(yàn)所需試劑為國產(chǎn)分析純，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配制。

1.3 儀器與設(shè)備 TB718包埋機(jī)：湖北泰維；Leica2135切片機(jī)：德國萊卡；Olympus BX51顯微鏡：日本奧林巴斯)；JD801顯微圖像分析系統(tǒng)：南京捷達(dá)。

2 方法

2.1 模型制備與評定

2.1.1 番瀉葉煎劑的制作 參考高蕊等[9]的報(bào)道，取番瀉葉加水煮沸約10 min，雙層紗布過濾，濾液減壓濃縮成1 g/mL的番瀉葉煎劑，冰箱保存，用時(shí)水浴加溫至25 ℃。

2.1.2 模型復(fù)制 參照周干南等[10]報(bào)道的小鼠腹瀉模型的制備方法：實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)2 d的健康小鼠，每日灌服番瀉葉煎劑0.5 mL，連續(xù)3 d(每日9:00灌胃，11:00—16:00每隔1 h更換濾紙，記錄1次，共5次)。每日灌胃后將小鼠單獨(dú)分開放入墊有濾紙的鼠籠飼養(yǎng)，于模型復(fù)制前將小鼠禁食10 h，自由飲水。

2.1.3 模型復(fù)制成功標(biāo)準(zhǔn) 模型復(fù)制后5 h內(nèi)，觀察有糞便不成形者或稀便且濾紙上有污跡者，即視為模型復(fù)制成功。

2.2 治療方法

2.2.1 腧穴定位 “天樞”“大腸俞”腧穴定位參照常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位的取穴標(biāo)準(zhǔn)[11]。

2.2.2 艾灸方法 天樞組取雙側(cè)天樞穴，大腸俞組取雙側(cè)大腸俞穴，天樞大腸俞組取同一側(cè)天樞、大腸俞(隔日交換對側(cè))，固定，采用直徑為0.7 cm、長為10 cm的清艾條懸于相應(yīng)穴位上方2 cm處，溫和灸20 min，每日1次，7 d為1個(gè)療程；正常組、模型組不予艾灸。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 腹瀉指數(shù) 模型復(fù)制結(jié)束后，把每只小鼠分別單獨(dú)放入鼠籠飼養(yǎng)，每只鼠籠內(nèi)皆備有一層濾紙且每小時(shí)更換1次濾紙，并記錄5 h內(nèi)小鼠排稀便的情況，計(jì)算腹瀉指數(shù)，并進(jìn)行組間比較。腹瀉指數(shù)計(jì)算參考相關(guān)報(bào)道[12]：腹瀉指數(shù)=稀便率(每只小鼠所排稀糞數(shù)/總便數(shù))×稀便級(以稀便污染濾紙形成污跡面積分級，分為4級。1級：污染直徑<1 cm；2級：1 cm≤污染直徑<2 cm；3級：2 cm≤污染直徑≤3 cm；4級：污染直徑>3 cm)，分開統(tǒng)計(jì)每一堆稀便的級數(shù)(稀便級=單只小鼠所有稀便級數(shù)總和/稀便總次數(shù))；級數(shù)直徑的測量：呈圓形的糞便直接測量直徑，呈橢圓形的糞便直徑取其最長和近似圓直徑的平均值；區(qū)分干便與稀便標(biāo)準(zhǔn)：以濾紙上有無污跡為主；糞便次數(shù)的統(tǒng)計(jì)：以每粒或每堆(不能分清粒數(shù)者)為1次。

2.3.2 AQP8、VIP及SP免疫陽性細(xì)胞表達(dá) 小鼠腹瀉指數(shù)統(tǒng)計(jì)完成后，選取正常組、模型組及療效最好的艾灸組用于免疫組織化學(xué)檢測；各組分別取8只小鼠脫頸椎處死，開腹取出小腸，截取長1 cm小腸放入4%中性甲醛中固定24 h，脫水，石蠟包埋、切片。參考試劑說明書進(jìn)行對應(yīng)染色。免疫組織化學(xué)染色后，胞膜、胞核或胞漿有棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。AQP8、VIP及SP免疫陽性細(xì)胞表達(dá)水平采用JD形態(tài)分析系統(tǒng)分別計(jì)算其吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠腹瀉指數(shù)比較 與正常組比較，模型組腹瀉指數(shù)顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，天樞組、大腸俞組、天樞大腸俞組腹瀉指數(shù)均顯著降低(P<0.05)；與大腸俞組、天樞組比較，天樞大腸俞組腹瀉指數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組小數(shù)腹瀉指數(shù)比較

注：與模型組比較，#P<0.05；與天樞大腸俞組比較，△P<0.05

3.2 各組小鼠AQP8、VIP及SP免疫陽性細(xì)胞表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組小腸組織AQP8免疫陽性細(xì)胞表達(dá)水平顯著減少(P<0.05)，VIP、SP免疫陽性細(xì)胞表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，天樞大腸俞組小腸組織AQP8免疫陽性細(xì)胞表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，VIP、SP免疫陽性細(xì)胞表達(dá)水平顯著減少(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組小鼠AQP8、VIP及SP表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

腹瀉是由于腸道對水分的吸收功能減弱或者分泌功能增強(qiáng)而導(dǎo)致大便糞質(zhì)含水量增加所致的一種腸道疾病[13]，屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”范疇，其基本病機(jī)為脾病濕盛，脾胃運(yùn)化功能失調(diào)，腸道功能失司[14]。

天樞穴屬胃經(jīng)，亦為大腸之募穴，主治腹脹腸鳴、便秘、泄瀉等疾病[15]54。大腸俞為大腸之背俞穴，《千金方》云：“大腸俞主暴泄”，即大腸俞具有理氣通腑、調(diào)和胃腸的功效。現(xiàn)代研究[16]發(fā)現(xiàn)，艾灸天樞穴可以降低腹瀉型腸易激綜合征小鼠的血清炎癥因子水平，可用于治療腹瀉。

圖1 各組小鼠AQP8、VIP及SP免疫陽性細(xì)胞表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色法，10×40倍)

俞募配穴是指同一臟腑的背俞穴和募穴配合使用的一種配穴方法，也稱前后配穴法[15]34。天樞穴配大腸俞為常見的治療腸腑疾病的俞募配穴法。俞募配穴旨在發(fā)揮協(xié)同作用，達(dá)到更好的治療效果，體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)“從陰引陽，從陽引陰”的思想，因“氣在胸者，止之膺與背俞。氣在腹者，止之背俞……”(《靈樞·衛(wèi)氣》)，即臟腑之氣與其俞、募穴密切相關(guān)，二者結(jié)合可發(fā)揮協(xié)同作用?，F(xiàn)代研究[17]認(rèn)為，同時(shí)刺激天樞、大腸俞可以調(diào)理腸胃，改善腸道功能。

AQP8是一種分布于動(dòng)植物組織器官中，在轉(zhuǎn)運(yùn)跨細(xì)胞水、分泌吸收液體中起著重要作用的水通道蛋白[18]。水通道蛋白參與了消化道水分的分泌和吸收，AQP8表達(dá)異常則會(huì)引起腹瀉[19]。因此，通過檢測腹瀉模型小鼠小腸組織AQP8免疫細(xì)胞表達(dá)水平，可以反映艾灸干預(yù)腹瀉過程中對AQP的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。VIP多存在于胃腸道黏膜的內(nèi)分泌細(xì)胞、黏膜下的細(xì)微神經(jīng)纖維以及腸肌神經(jīng)叢等[20]。生理情況下，VIP具有胃腸激素作用和神經(jīng)肽的雙重功能， 促進(jìn)腸道水、電解質(zhì)、胰液及腸液的分泌, 調(diào)節(jié)胃腸吸收，還具有抗炎作用[21]。SP在腸道中含量較豐富，可興奮平滑肌、舒張血管和促進(jìn)腺體分泌等，參與感覺信息傳遞、胃腸活動(dòng)、痛覺調(diào)制、心血管活動(dòng)、神經(jīng)內(nèi)分泌等復(fù)雜的生理功能[22]。

本研究表明，艾灸不同腧穴可顯著降低腹瀉模型小鼠的腹瀉指數(shù)，且天樞大腸俞組效果最佳，說明天樞與大腸俞配伍治療腹瀉具有協(xié)同效應(yīng)；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與模型組比較，天樞大腸俞組小腸組織AQP8免疫陽性細(xì)胞表達(dá)顯著增加(P<0.05)，VIP、SP免疫陽性細(xì)胞表達(dá)均顯著減少(P<0.05)，小腸組織AQP8表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)腸道水分吸收，改善糞質(zhì)性狀，而VIP、SP的增加可刺激腸道蠕動(dòng)，增加排便次數(shù)，對VIP、SP免疫陽性細(xì)胞表達(dá)的抑制可緩解胃腸道的不適，減輕腹瀉[23-24]。艾灸不同腧穴治療腹瀉的機(jī)制可能與上調(diào)AQP8表達(dá)或下調(diào)VIP、SP表達(dá)有關(guān)。