二甲雙胍單次和多次給藥對大鼠機(jī)械通氣性腦損傷的影響

顏克實, 王偉偉, 余 鑫, 陸大浩, 戴 晨, 高 巨

(揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇省蘇北人民醫(yī)院 麻醉科, 蘇北人民醫(yī)院麻醉與急危重癥研究所, 江蘇 揚州, 225001)

機(jī)械通氣是全身麻醉和急危重癥患者的重要治療措施，但長時間機(jī)械通氣可導(dǎo)致呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷(VILI), 誘發(fā)腦組織炎性改變和神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致腦損傷及功能異常，其機(jī)制可能與炎性因子有關(guān)[1-4]。二甲雙胍是目前治療2型糖尿病(T2DM)的有效方法之一，目前已發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以預(yù)防T2DM患者的糖尿病心腦血管病變，降低高危人群的糖尿病發(fā)生率[5]。最近研究[6-8]指出，二甲雙胍治療和預(yù)防疾病的作用不再限于傳統(tǒng)的糖尿病治療，甚至可抗抑郁，降低癌癥風(fēng)險，延長血糖正常小鼠壽命，延緩衰老。研究[9]表明，單次給予小鼠二甲雙胍對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥有腦保護(hù)作用，也有研究[10]認(rèn)為多次給藥可引起健康小鼠的焦慮和認(rèn)知功能受損。本研究擬通過建立大鼠機(jī)械通氣致腦損傷模型，探討單次及多次給予二甲雙胍對該模型的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康成年雄性Wister大鼠24只，體質(zhì)量200～220 g, 由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。采取隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組，即對照組(C組)、機(jī)械通氣組(MV組)、機(jī)械通氣+單次二甲雙胍組(MET組)、機(jī)械通氣+多次二甲雙胍組(M-MET組)，每組6只。

1.2 方法

M-MET組實驗前喂食二甲雙胍500 mg/(kg·d), 持續(xù)4周; MET組實驗前喂食二甲雙胍500 mg/kg, 實驗前禁食10 h, 自由飲水。腹腔注射0.7%水合氯醛5 mL/kg麻醉大鼠，麻醉后行氣管插管術(shù)。按照文獻(xiàn)[2]方法制備機(jī)械通氣致腦損傷大鼠模型。C組保留自主呼吸。MV組、MET組和M-MET組接 DW 3000型小動物呼吸機(jī)(安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)行機(jī)械通氣。呼吸參數(shù)設(shè)置: 吸呼比(I∶E)為1∶2, 潮氣量(VT)40 mL/h, 通氣頻率為40次/min, 吸入氧濃度(FiO2)21%, 通氣時間6 h。機(jī)械通氣結(jié)束后立即斷口處死取腦，冰上快速分離海馬并取部分海馬組織，置于4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行石蠟包埋處理，制備病理切片，常規(guī)HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)改變。取剩下的腦組織冷凍并保存在-80 ℃條件下，檢測時用低溫組織勻漿器制成10%組織勻漿，離心后取上清液采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白濃度，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平均采用試劑盒進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦組織病理學(xué)改變

C組海馬組織未見明顯病理學(xué)改變, MV組與其相比細(xì)胞排列散亂、稀疏，細(xì)胞間隙增大，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少且腫脹，胞體不規(guī)則，核仁不清，可見核固縮。同MV組相比, MET組損傷明顯減輕，神經(jīng)元層次增加，排列相對整齊致密，間隙較小，神經(jīng)元數(shù)目相對較多，胞體相對規(guī)則，核仁清晰。M-MET組病理學(xué)改變介于MET組合MV組之間。見圖1。

2.2 腦組織IL-6、TNF-α、MDA和SOD水平比較

與C組相比，另3組的IL-6、TNF-α和MDA水平升高，SOD水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與MV組相比, MET組和M-MET組大鼠炎性因子IL-6、TNF-α和MDA水平降低, SOD水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與MET組相比, M-MET組IL-6、TNF-α和MDA水平升高, SOD水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

A: C組; B: MC組; C: MET組; D: M-MET組。

圖1 光鏡下各組大鼠腦組織病理學(xué)改變(放大倍數(shù)400倍)

表1 4組大鼠腦組織IL-6、TNF-α、SOD和MDA水平比較

IL-6: 白介素-6; TNF-α: 腫瘤壞死因子-α; SOD: 超氧化物歧化酶; MDA: 丙二醛。

與C組相比, *P<0.05; 與MV組相比, #P<0.05; 與MET組相比, △P<0.05。

3 討 論

對很多重癥患者而言，機(jī)械通氣是重要的生命支持手段，但機(jī)械通氣時肺上皮和內(nèi)皮水平的機(jī)械信號經(jīng)傳導(dǎo)觸發(fā)生物信號，形成炎癥級聯(lián)反應(yīng)，炎癥介質(zhì)促進(jìn)局部組織損傷，甚至可能擴(kuò)散到腦等其他遠(yuǎn)端器官和系統(tǒng)，加重甚至誘發(fā)肺損傷[11-12]。研究[13]認(rèn)為，由于平均氣道壓力增大，淋巴引流減少，機(jī)械通氣可能會損害局部血流和大腦氧合，尤其是長期進(jìn)行機(jī)械通氣的患者可能出現(xiàn)記憶認(rèn)知改變。因此，抑制炎癥及應(yīng)激則會改善機(jī)械通氣造成的腦損傷。本研究中，炎癥因子的增加和氧化應(yīng)激標(biāo)志物的變化與機(jī)械通氣后大腦組織病理學(xué)改變的程度相符，印證了炎癥與機(jī)械通氣致腦損傷有密切相關(guān)性。

大量研究[9, 14]證實二甲雙胍對腦具有神經(jīng)保護(hù)作用，二甲雙胍可保護(hù)血腦屏障，減少內(nèi)毒素LPS致腦損傷，抑制活性氧(ROS)產(chǎn)生，其機(jī)制可能與腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活和核因子κB(NF-κB)的抑制相關(guān)。另一項研究[15]顯示，二甲雙胍可以通過抗炎、抗氧化作用，激活PI3K/Akt信號通路來保護(hù)小鼠的大腦皮質(zhì)、紋狀體和海馬的神經(jīng)元從而減少敗血癥的侵害。本研究結(jié)果表明，二甲雙胍減輕了機(jī)械通氣誘發(fā)大鼠腦損傷的機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激，降低炎性因子水平相關(guān)。

二甲雙胍作為AMPK激動劑，抑制細(xì)胞氧耗，減少ATP產(chǎn)生。研究[16]表明，多次或大劑量二甲雙胍處理，糖酵解ATP產(chǎn)生中的作用無法補(bǔ)

償二甲雙胍對線粒體氧化磷酸化的抑制作用，最終改變代謝信號，抑制炎性因子能力減弱，損傷海馬組織，且二甲雙胍的生物利用度隨著劑量的增加而逐漸降低并發(fā)生膜轉(zhuǎn)運蛋白飽和，因而腦保護(hù)作用不會隨著服藥時間以及劑量的累積而增加，甚至可能有相反的作用。本研究結(jié)果顯示, MET組對炎性因子及氧化應(yīng)激的抑制能力以及腦保護(hù)作用優(yōu)于M-MET組。

綜上所述，二甲雙胍可減輕機(jī)械通氣誘發(fā)的大鼠腦損傷，其機(jī)制可能與抑制炎性通路和氧化應(yīng)激有關(guān)，且單次給藥的效果優(yōu)于多次給藥。