翼狀胬肉形成相關(guān)基因的表達研究

趙 牧，王 宇，2

（1.攀枝花學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，四川 攀枝花617000；2.攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 攀枝花617000）

翼狀胬肉是一種常見的眼表疾病，局部球結(jié)膜纖維血管組織呈三角形膜樣增生侵犯角膜而引發(fā)形成，其酷似昆蟲翅膀而得名。紫外線、風(fēng)沙、過敏等因素是引發(fā)該病的主要外部因素，發(fā)病機理涉及解剖學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)及病毒學(xué)等多個領(lǐng)域，但現(xiàn)在仍然存在爭議［1-2］。目前，翼狀胬肉的治療仍以手術(shù)為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，具有某些腫瘤樣特性，所以現(xiàn)在很多學(xué)者將其作為一種良性腫瘤樣病變進行研究，取得了一些研究成果［3］。

本研究通過前期構(gòu)建的翼狀胬肉cDNA文庫，找到一些在翼狀胬肉組織中表達的基因，通過采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)比較這些基因在翼狀胬肉與正常結(jié)膜組織中的表達差異，從分子水平上探討翼狀胬肉形成的病因，為其進一步的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

32例翼狀胬肉組織標(biāo)本隨機取自攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院的眼科手術(shù)病人，其中男18例，女14例，年齡為38-72歲，平均年齡49.2歲，所有患者均無其他結(jié)膜疾患。同時將患者眼角膜上緣上方的切緣中的正常球結(jié)膜組織作為對照，手術(shù)取樣后迅速置于液氮中，-80℃保存。

1.2 主要儀器和試劑

總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，RNase-free DNase I購于Fermentas公司，熒光定量PCR試劑盒、凝膠成像系統(tǒng)和PCR儀購于美國伯樂公司，微量紫外分光光度計購于美國貝克曼公司。PCR引物由蘇州金唯智公司合成。

1.3 引物設(shè)計

使用Primer5.0軟件設(shè)計特異性定量PCR引物，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行引物特異性比對，引物具體信息見表1。

表1 PCR引物序列

1.4 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

按照微量樣品總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）的使用說明操作提取翼狀胬肉組織的總RNA，然后用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA的完整性和純度。為了消除基因組DNA的污染，用RNase-free DNase I對總RNA進行處理，最后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.5 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)

以人18SrRNA為內(nèi)參基因，用qRT-PCR對基因表達進行檢測，反應(yīng)體系為25μL：1μL cDNA，12.5μL SYBR Green mixture，上下游引物（10μM）各0.5μL，10.5μL水。反應(yīng)體系為：95℃預(yù)變性10 min；然后95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s進行42個循環(huán)，添加熔解曲線，確保擴增產(chǎn)物的特異性，每個樣品重復(fù)測定3次。采用2-ΔΔCt法對qRT-PCR得到的試驗數(shù)據(jù)進行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

各項數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組樣本間采用t檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的鑒定

從翼狀胬肉及正常球結(jié)膜組織中抽提總RNA，經(jīng)凝膠電泳檢測，RNA無明顯降解；紫外分光光度計檢測，之間，表明RNA純度較高，可用于后續(xù)實驗。

2.2 基因的表達檢測

通過檢測干擾素誘導(dǎo)蛋白（IFI27）、三葉肽因子3（TFF3）、橋粒斑蛋白（Pkp2）、Rho GTPase激活蛋白（RhoGAP）、活性氧調(diào)節(jié)因子（ROMO1）和環(huán)氧化酶2（COX-2）的表達水平，發(fā)現(xiàn)這些基因在翼狀胬肉組織中的表達明顯高于正常球結(jié)膜組織（P＜0.01）（圖1）。

3 討論

翼狀胬肉的發(fā)病機制非常復(fù)雜，環(huán)境因素的刺激與翼狀胬肉的發(fā)生密切相關(guān)，尤其是海員、漁民、沙石工人長期受到強烈光線照射、風(fēng)沙、煙塵等因素的影響，使角膜緣部結(jié)膜血管或結(jié)膜組織發(fā)生非感染性慢性炎癥，最終造成彈性纖維與膠原纖維的增生和變性，這是翼狀胬肉較為突出的病理改變，同時大量的基因突變也會啟動正常結(jié)膜及纖維血管組織過度增殖而引起翼狀胬肉［4］?，F(xiàn)在研究表明長期接觸生產(chǎn)性毒物如氟、砷、二氧化硫和粉塵，也會導(dǎo)致翼狀胬肉［5］。

圖1 差異表達基因的qRT-PCR分析

本研究通過對上述基因的研究，可以發(fā)現(xiàn)翼狀胬肉也是一種與血管生成、纖維生成和炎性因子相關(guān)的疾病。干擾素誘導(dǎo)蛋白（IFI27）是干擾素誘導(dǎo)蛋白200家族的成員之一，參與了多種細胞活動，包括炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細胞增殖，細胞凋亡等，已有研究表明干擾素誘導(dǎo)蛋白主要介導(dǎo)Thl型炎癥反應(yīng)，其家族成員的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［6-7］。橋粒斑蛋白（Pkp2）是橋粒的主要蛋白成分之一，起連接細胞內(nèi)中間絲和橋粒的作用，它不僅與離子轉(zhuǎn)運相關(guān)通道有關(guān)，而且通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)其在鱗癌、腺癌等多種癌細胞內(nèi)進行表達，已成為腫瘤檢測的標(biāo)記物［8］。三葉肽因子3（TFF3）是一類富含半膀氨酸的小分子肽，在外周血中能夠穩(wěn)定測定，是一種重要的信息分子。它與黏液糖蛋白相互作用，可誘導(dǎo)上皮細胞遷移，促使損傷后黏膜快速修復(fù)；TFF3可能通過酪氨酸或雙重特別性磷酸酶活性的激活調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信息通道，能抑制有絲分裂原激活的蛋白激酶和信息相關(guān)蛋白激酶的活性，從而參與信號傳導(dǎo)，TFF3也可能為角膜內(nèi)的浸潤提供傳導(dǎo)信號［9-10］。Rho GTPase激活蛋白（RhoGAP）是Ras超家族的成員之一，具有GTPase酶活性。它是一種多信號調(diào)控分子，可以調(diào)節(jié)多種細胞功能并且能和其他蛋白相互作用，參與細胞的多項生命活動，如肌動蛋白細胞骨架的重構(gòu)、細胞黏附和運動、囊泡運輸、基因表達和細胞周期的調(diào)控等［11-12］。由于Rho GTPase在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有著重要的作用，對于揭示信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制和臨床上多種疾病的發(fā)病機制具有重要的指導(dǎo)意義?；钚匝跽{(diào)節(jié)因子（ROMO1）是一種新型的線粒體跨膜蛋白，可以控制細胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平，對細胞的增殖產(chǎn)生決定性作用，因此可以通過誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生ROS發(fā)揮致癌作用［13］。ROS不僅可以引起DNA的氧化損傷，還能通過化學(xué)機制產(chǎn)生環(huán)氧化酶2（COX-2）。COX-2由604個氨基酸組成，是一種“應(yīng)答基因”，正常狀態(tài)下在多數(shù)組織中不表達，在各種誘導(dǎo)因子的刺激下進行表達，調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化，它也是促進翼狀胬肉形成的一種重要誘導(dǎo)酶［14］。

本研究通過發(fā)現(xiàn)一些可能參與翼狀胬肉形成的基因，為從分子學(xué)角度深入研究翼狀胬肉的發(fā)病機制提供了幫助。下一步可以進行深入研究，能否將上述基因作為翼狀胬肉早期診斷的分子標(biāo)志物，同時可以作為治療的分子靶標(biāo)，利用RNA干擾技術(shù)阻礙其表達，達到治療的目的。