EtOH/K2HPO4雙水相體系萃取分離絞股藍(lán)中的總黃酮

張亦琳，張 琴，王 吾，鄢 強(qiáng)，王銀銀

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

0 引言

絞股藍(lán)為葫蘆科植物的全草，主要分布在亞洲國(guó)家，具有清熱排毒的功效，對(duì)于治療病毒性肝炎、慢性支氣管炎、體虛乏力等癥在臨床上有確切的療效[1,2]，被"星火計(jì)劃"列為需開(kāi)發(fā)的"名貴藥材"首位。2002年，絞股藍(lán)被列入保健產(chǎn)品清單，可以制成保健茶等功能性食品[3]。

絞股藍(lán)采用乙醇提取效果最好，得到粗提物，無(wú)法確定具體活性成分，但是藥效得到廣泛認(rèn)可，藥理作用主要體現(xiàn)在皂苷、黃酮和多糖等成分中[4]。研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)中含有大量皂苷，含量約為人參的3倍[5, 6]，總黃酮含量約為3%～5%[7]，主要有商陸素、蘆丁、槲皮素及蕓香苷等十余種[8]。近年興起的微波萃取技術(shù)[9]能有效分離絞股藍(lán)總黃酮和總皂苷，但是對(duì)設(shè)備要求較高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此開(kāi)發(fā)條件溫和、成相穩(wěn)定、用時(shí)較短的雙水相萃取技術(shù)對(duì)拓展絞股藍(lán)的應(yīng)用領(lǐng)域和工業(yè)化生產(chǎn)有重要意義。

雙水相萃取技術(shù)的原理是被分離物在兩相中的溶解特性不同，實(shí)現(xiàn)兼具分離和純化雙重功能的技術(shù)[10,11]，而且親水性兩相體系可提供良好的生物環(huán)境[12]，實(shí)現(xiàn)藥用植物活性成分的分離純化。筆者采用EtOH/NaCl、EtOH/Na2CO3、EtOH/KBrO3、EtOH/K2HPO4和EtOH/(NH4)2SO45種雙水相體系，用于分離絞股藍(lán)中的總黃酮和總皂苷，運(yùn)用相平衡原理分析不同雙水相體系中總黃酮的分配特征，確定最佳雙水相萃取體系，實(shí)現(xiàn)絞股藍(lán)總黃酮和總皂苷的有效分離，為絞股藍(lán)的提取分離開(kāi)拓新的思路。

1 材料

UV1780型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津有限公司)

絞股藍(lán)購(gòu)自北京同仁堂西安大藥房、人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自南京道斯夫生物科技有限公司；KBrO3、(NH4)2SO4購(gòu)自成都西亞試劑有限公司；NaCl、Na2CO3、K2HPO4購(gòu)自西安順達(dá)化學(xué)試劑儀器公司。

2 方法

2.1 乙醇/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系成相

在常溫常壓下，以EtOH為有機(jī)相，NaCl、KBrO3、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2HPO4五種鹽作為試驗(yàn)用無(wú)機(jī)鹽，通過(guò)濁點(diǎn)滴定法分別繪制EtOH與上述鹽在水中的相圖[13]。將無(wú)機(jī)鹽(ms)溶于水(mw)，滴加EtOH后振蕩混合至出現(xiàn)渾濁，記錄消耗EtOH質(zhì)量(mei)和溶液總質(zhì)量(mi)；然后繼續(xù)加入去離子水(mwj)至澄清，此時(shí)體系的總質(zhì)量為mj；再滴加無(wú)水EtOH，振蕩混合至渾濁，如此反復(fù)操作，并繪制相圖。

EtOH質(zhì)量濃度：ωei=∑mei/mi(i=1，2，3，…，n)鹽的質(zhì)量濃度：ωs=∑ms/mj(j=1，2，3，…，n)

2.2 乙醇/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系的選擇

向EtOH和無(wú)機(jī)鹽體系中加入提取液，混勻后離心，測(cè)定樣品各相的吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得絞股藍(lán)總黃酮的濃度，考察相比(R)、分配系數(shù)(K)和萃取率(Y)。相比計(jì)算公式R = Vt/Vb，其中，Vt、Vb分別是上、下相體積(mL)；分配系數(shù)(K)的計(jì)算公式為K=Ct/Cb，其中Ct、Cb分別是上下相提取液的質(zhì)量濃度(g/L)；萃取率(收率)計(jì)算公式Y(jié)=RK/(1+RK)。

2.3 供試液的準(zhǔn)備

在EtOH濃度80%，提取溫度60℃，料液比1∶10，提取時(shí)間為120 min條件下(通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法確定的提取參數(shù))提取絞股藍(lán)(5 g)，得到提取液總黃酮的含量：0.3713 mg·mL-1，總皂苷的含量：2.6123 mg·mL-1。

2.4 分析方法

總黃酮分析波長(zhǎng)的確定：在200～600 nm區(qū)間內(nèi)，通過(guò)紫外分光光度計(jì)對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液和雙水相體系供試液的各相進(jìn)行掃描，最大吸收峰為510 nm。

總皂苷分析波長(zhǎng)的確定：在200～600 nm區(qū)間內(nèi)，加入顯色劑香草醛-高氯酸-冰醋酸對(duì)人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)液和雙水相的各相進(jìn)行預(yù)處理后，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，最大吸收峰為550 nm。

3 結(jié)果

3.1 乙醇/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系分相能力

常溫下，調(diào)整無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，通過(guò)濁點(diǎn)法繪制各體系相圖。實(shí)驗(yàn)證明：NaCl無(wú)法與EtOH形成雙水相；(NH4)2SO4容易沉淀，形成的體系缺乏穩(wěn)定性；而KBrO3、Na2CO3、K2HPO4則可與EtOH形成較為穩(wěn)定的雙水相體系，結(jié)果如圖1所示。EtOH/Na2CO3、EtOH/K2HPO4、EtOH/KBrO33種雙水相體系中，Na2CO3的相分離范圍稍窄；KBrO3雖能穩(wěn)定分相，但萃取分離能力較差；K2HPO4在EtOH中相分離范圍廣，萃取能力強(qiáng)。因此選擇EtOH/K2HPO4系統(tǒng)用于提取分離絞股藍(lán)總黃酮的雙水相體系。

3.2 EtOH/K2HPO4雙水相體系分離純化絞股藍(lán)總黃酮的最佳參數(shù)

3.2.1 乙醇和水的體積比對(duì)EtOH/K2HPO4雙水相體系的影響 當(dāng)加入固定量的EtOH和水時(shí)，K2HPO4的加入量越多，下相體積越大，最后達(dá)到飽和；當(dāng)加入固定量的EtOH和K2HPO4時(shí)，如加入水過(guò)多，則體系不能維持雙水相狀態(tài)，如加入水太少，K2HPO4不能完全溶解；當(dāng)加入恒定量的K2HPO4和水時(shí)，EtOH加入量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致K2HPO4沉淀，EtOH加入量過(guò)少會(huì)導(dǎo)致不能形成雙水相。結(jié)合圖1，最終對(duì)水與EtOH的體積比為5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7做進(jìn)一步研究。

3.2.2 磷酸鹽含量對(duì)EtOH/K2HPO4雙水相體系的影響 在水和EtOH體積比分別為5∶5、4∶6、3 ∶7的條件下，改變K2HPO4的添加量，并測(cè)定萃取后上下相的吸光度，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，當(dāng)EtOH或K2HPO4的含量增大時(shí)，上相絞股藍(lán)總黃酮的含量會(huì)減小。當(dāng)K2HPO4的加入量恒定時(shí)，下相溶液的體積隨著EtOH濃度增高而減小，提高了K2HPO4的濃度，溶液堿性增大，總黃酮的溶解度增加；當(dāng)EtOH加入量恒定時(shí)，隨著K2HPO4加入增多，上相EtOH濃度增加，總黃酮的濃度也增加。在形成過(guò)程中，EtOH和K2HPO4在雙水相體系中競(jìng)爭(zhēng)水分子，K2HPO4與水更易結(jié)合，從而降低了上相溶液中總黃酮的含量。實(shí)驗(yàn)表明，V水∶VEtOH=3 ∶7時(shí)，體系的分配系數(shù)和萃取率最高，且隨K2HPO4加入量增加，相比減小，分配系數(shù)增加，萃取率變化較小，因此，選用V水∶VEtOH=3 ∶7，K2HPO4的加入量為2.0 g為雙水相萃取體系的最佳體系。該體系EtOH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.49%，K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.01%，此時(shí)相比R為2.84，分配系數(shù)K為19.87，總黃酮的萃取率Y為98.26% 。

3.2.3 EtOH/K2HPO4雙水相體系萃取絞股藍(lán)總黃酮的應(yīng)用 將制備好的絞股藍(lán)供試液加入到最佳雙水相體系中，混合均勻，上下相分配完全后，離心分相，測(cè)定供試液的吸光度，結(jié)果如圖3所示。萃取前，絞股藍(lán)供試液中總黃酮含量為2.1992 g·mL-1，體積為5.4 mL；萃取后上相濃度為6.1294 g·mL-1，體積為6.7 mL；下相濃度為0.5609 g·mL-1，體積為1.3 mL。由此可知，絞股藍(lán)總黃酮主要富集在EtOH/K2HPO4雙水相體系的上相中，純度較高。

絞股藍(lán)提取液不僅含有豐富的黃酮類化合物，還有較多的皂苷，因此我們進(jìn)一步測(cè)定了在最佳EtOH/K2HPO4雙水相體系下絞股藍(lán)皂苷在上下相中的分配情況，結(jié)果如圖4所示。實(shí)驗(yàn)表明，用雙水相體系萃取后，絞股藍(lán)皂苷主要富集在下相，而黃酮主要富集在上相，從而在一定程度上實(shí)現(xiàn)了純化絞股藍(lán)黃酮的目的。

3 結(jié)論

絞股藍(lán)因其藤蔓較多，提取前需要完全粉碎，以增加有效成分的溶解。黃酮是絞股藍(lán)中含量較多的物質(zhì)之一，大部分能溶于乙醇，因此雙水相試驗(yàn)中使用EtOH作為溶劑，而且EtOH具有較大的水化能，很少有無(wú)機(jī)鹽能與其形成雙水相，且相比R難趨近于1[14]。K2HPO4在EtOH/H2O溶液中，有相當(dāng)寬的相分離區(qū)間和較高的K，同時(shí)，K2HPO4是弱堿鹽，能夠使體系得pH保持在弱堿性環(huán)境中，確保了黃酮在體系中的完全溶解，并且也不會(huì)因堿性過(guò)高而使黃酮失活。本研究最后確定的最佳EtOH/K2HPO4體系為：EtOH的體積分?jǐn)?shù)為52.49%，K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.01%，此時(shí)K為19.87，R為2.84，總黃酮的萃取率為98.26%。絞股藍(lán)總黃酮在EtOH上相富集，而易溶于水的皂苷等水溶性成分主要富集在下相，此萃取技術(shù)實(shí)現(xiàn)了黃酮與皂苷化合物的提取分離，在絞股藍(lán)活性物質(zhì)的分離方面有較大應(yīng)用前景。