乳腺炎奶牛乳腺組織損傷的原因及防治措施

陳伶慧 劉靜雨 申艷超

摘要? ? 乳腺炎作為一種乳腺炎癥反應(yīng)，給奶牛場造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。乳腺炎奶牛的乳腺組織在細(xì)菌因子和宿主免疫等作用下其上皮組織受到損傷，其相關(guān)機(jī)制有待深入研究。本文從細(xì)胞凋亡或壞死、細(xì)菌感染、中性粒細(xì)胞、血漿蛋白等方面總結(jié)了奶牛乳腺炎乳腺組織損傷的原因，并提出防治措施，以期為有效防控奶牛乳腺炎提供科學(xué)理論基礎(chǔ)和技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞? ? 奶牛;乳腺炎;乳腺組織損傷;原因;防治

中圖分類號? ? S858.23;S857.2+6? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? ? A

Abstract? ? Mastitis，as an inflammation of the breast，causes huge economic losses in dairy farms.The mammary gland tissue of dairy cows with mastitis is damaged by bacterial factors and host immunity，and the related mechanisms need to be further studied.This paper summarized the causes of breast tissue damage in dairy cow with mastitis from apoptosis or necrosis， bacterial infection，neutrophils，plasma protein and other aspects，and put forward prevention and treatment measures in order to provide scientific theoretical basis and technical reference for effective prevention and control of dairy cow mastitis.

Key words? ? cow;mastitis;mammary tissue damage;cause;prevention and treatment

全世界約有奶牛2.2億頭，其中約有1/3患有各種類型乳腺炎，且以隱性乳腺炎發(fā)病率最高。每年因奶牛乳腺炎造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)350億美元，僅美國一年的損失就高達(dá)20億美元以上，因而乳腺炎被稱為“奶牛場最昂貴的傳染病”[1]。乳腺炎一般由機(jī)械、物理、化學(xué)、病原微生物等引起，其中病原微生物（細(xì)菌、支原體、真菌、病毒等）感染是引起乳腺炎的主要原因。感染乳腺炎后，奶牛乳腺組織在細(xì)菌因子和宿主免疫等作用下其上皮組織受到損傷，其相關(guān)機(jī)制有待深入研究[2]。本文擬從細(xì)胞凋亡或壞死、細(xì)菌感染、中性粒細(xì)胞、血漿蛋白等方面總結(jié)奶牛乳腺炎乳腺組織損傷的原因，并提出防治措施，以期為有效防控奶牛乳腺炎提供科學(xué)理論基礎(chǔ)和技術(shù)參考。

1? ? 乳腺炎及上皮組織損傷的發(fā)生

1.1? ? 乳腺炎發(fā)生

乳頭管是乳腺的第一道防線，腺管中的角蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)提供了抗細(xì)菌滲透的物理的化學(xué)屏障。當(dāng)細(xì)菌通過乳頭管進(jìn)入乳腺后，細(xì)菌克服乳腺細(xì)胞—體液防御機(jī)制后，引起乳腺炎癥反應(yīng)。如果擠奶后的細(xì)菌感染未完全消除，乳腺中的細(xì)菌水平最終上升并開始破壞乳腺上皮，則牛奶中體細(xì)胞數(shù)量不斷增加，組織損傷加劇。當(dāng)細(xì)胞外液進(jìn)入腺體并與乳汁混合時，乳汁和乳腺開始出現(xiàn)明顯的變化，包括外部腫脹、腺體發(fā)紅、乳汁凝固，呈現(xiàn)顯著乳腺炎癥狀[3]。

1.2? ? 乳腺上皮組織損傷

感染乳腺炎后，奶牛乳腺組織在細(xì)菌因子和宿主免疫等作用下其上皮組織受到損傷，依據(jù)不同感染源，不同奶牛發(fā)病的嚴(yán)重程度差別很大[4]。大腸桿菌乳腺炎的中度病例中，存在最小的組織損傷。其主要表面變異是局限于乳頭竇上皮、乳突竇及大導(dǎo)管，無分泌組織受到影響，而且基底膜損傷一般都是局部損傷[4]。對于葡萄球菌引起的慢性乳腺炎來說，感染后，多形核白細(xì)胞浸潤到乳腺壞死的分泌組織中，導(dǎo)致乳腺組織損傷，使乳泡泡間基質(zhì)和乳泡上皮萎縮導(dǎo)致奶牛表現(xiàn)出乳汁合成和分泌較少[5]。在乳腺組織損傷后，位于乳腺上皮細(xì)胞的溶酶體中乙酰氨基葡萄糖苷酶從受損的乳腺上皮細(xì)胞中釋放到細(xì)胞外。因此，乙酰氨基葡萄糖苷酶活性常被用作組織損傷的標(biāo)志物[6]。

2? ? 乳腺上皮組織損傷原因

2.1? ? 細(xì)胞凋亡與壞死

細(xì)胞凋亡在乳腺發(fā)育和發(fā)揮泌乳功能過程中起到重要作用。在哺乳期和哺乳后期，細(xì)胞凋亡對于去除分泌乳汁的乳腺上皮細(xì)胞至關(guān)重要[7]。Long等[8]已證實乳腺炎期間細(xì)胞凋亡的發(fā)生。對感染大腸桿菌的乳腺進(jìn)行活檢以及mRNA和蛋白質(zhì)分析表明，乳腺炎過程中乳腺組織損傷后，凋亡因子bax和Il-1β轉(zhuǎn)化酶上調(diào)，抗凋亡因子Bcl-2下調(diào)，凋亡上皮細(xì)胞數(shù)量顯著上升。此外，有證據(jù)表明，其他乳腺炎病原體同樣誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。例如，鏈球菌感染的乳腺炎牛，會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和睪酮抑制前列腺黏蛋白5倍高表達(dá)[9];Bayles等[10]在體外研究表明，金黃色葡萄球菌也會引起牛乳腺細(xì)胞凋亡。當(dāng)脂多糖處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，上皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，泛素樣連接酶1通過過度表達(dá)抑制了 TLR4/NF-κB通路的激活，減輕了LTA誘導(dǎo)的ER應(yīng)激、凋亡、自噬和氧化應(yīng)激，從而減輕炎癥反應(yīng)和上皮細(xì)胞損傷。

2.2? ? 中性粒細(xì)胞

中性粒細(xì)胞的主要功能是通過氧依賴和非氧依賴系統(tǒng)消滅病原體。當(dāng)檢測到病原體侵入乳腺后，血液中中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著上升，巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞釋放出化學(xué)引誘物觸發(fā)中性粒細(xì)胞從血液向乳腺炎癥部位的遷移并殺死病原體，是早期免疫反應(yīng)的標(biāo)志[11]。因此，功能性PMN的存在對于宿主防御細(xì)菌病原體至關(guān)重要，被認(rèn)為是乳腺的第二道防線。中性粒細(xì)胞通過多種機(jī)制防御病原體。一方面，由于PMN內(nèi)顆粒含有殺菌肽、蛋白質(zhì)和各種酶類，如組織蛋白酶G、巰基蛋白酶、組織蛋白酶B、酸性蛋白酶D和被釋放到吞噬液泡或細(xì)胞外環(huán)境中的髓過氧化物酶，清除感染或受損的宿主細(xì)胞和碎片，能終止急性炎癥反應(yīng)[12]。另一方面，PMN擁有一系列細(xì)胞表面受體，使它們能夠粘附并通過內(nèi)皮細(xì)胞遷移，識別并吞噬細(xì)菌。中性粒細(xì)胞表面受體CD14，在控制革蘭氏陰性細(xì)菌的感染方面受到相當(dāng)大的關(guān)注。在體外脂多糖（LPS）感染奶牛乳腺上皮細(xì)胞過程中，PMN迅速聚集到感染區(qū)域，脂多糖與高表達(dá)CD14的中性粒細(xì)胞分泌的可溶性CD14結(jié)合，導(dǎo)致脂多糖中和。同時，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞中腫瘤壞死因子α和敗血癥的釋放。此外，通過可溶性CD14等增強PMN反應(yīng)的重組蛋白或介導(dǎo)PMN凋亡的藥物來操縱PMN，可作為治療乳腺炎的新療法[13]。中性粒細(xì)胞也會導(dǎo)致乳腺上皮組織發(fā)生損傷，但是其確切機(jī)制尚不完全清楚?；罨难篜MN對乳腺上皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒性[14]，可能通過釋放細(xì)胞外活性氧，如羥基自由基、顆粒酶的釋放，氧化應(yīng)激會損害所有類型的生物分子（如DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物），誘導(dǎo)組織損傷，干擾乳腺功能[15]。

2.3? ? 細(xì)菌

內(nèi)毒素脂多糖是革蘭氏陰性菌致病性的關(guān)鍵因子。因此，乳腺內(nèi)注入大腸桿菌脂多糖常用于研究大腸桿菌感染乳腺以模擬自然發(fā)生的乳腺炎的癥狀。在這過程中，能夠?qū)θ橄偕掀ぜ?xì)胞造成直接的損傷[16]。當(dāng)LPS用于誘發(fā)乳腺炎癥反應(yīng)時，在乳腺中、泌乳組織以及上皮細(xì)胞中均觀察到病變，其原因可能是因為脂多糖通過MAC-T細(xì)胞（一種已建立的牛乳腺上皮細(xì)胞系）刺激IL-1的表達(dá)[17]。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒素破壞細(xì)胞膜，直接損傷產(chǎn)奶組織，導(dǎo)致牛乳腺壞死，而且能夠侵入乳腺上皮細(xì)胞很長時間，其導(dǎo)致的乳腺炎通常很難治療并易于復(fù)發(fā)。半乳糖鏈球菌同樣侵染乳腺上皮細(xì)胞，但侵襲過程并不影響哺乳動物上皮細(xì)胞的活力，但誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，如乳酸脫氫酶釋放量增加[18]。大腸桿菌是引起乳腺炎的主要原因。通過乳腺上皮粘附、浸潤、反復(fù)感染，導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞凋亡和組織損傷，而且對幾種抗菌藥物有先天抵抗力，從而增強了對這些化合物的抵抗力[19]。

2.4? ? 血漿蛋白和細(xì)胞因子

牛奶含有2種來源于血液的蛋白酶系統(tǒng)，其中一種與溶解血凝塊有關(guān)，即纖維蛋白酶;另一種防御入侵微生物，即體細(xì)胞溶酶體原。纖溶酶是優(yōu)質(zhì)牛奶中的主要蛋白酶，隨著牛奶體細(xì)胞計數(shù)的增加，其他蛋白酶，包括組織蛋白酶和彈性蛋白酶也起到積極作用[20]。乳腺炎發(fā)病時，乳腺上皮的血乳屏障滲透性增加，首先導(dǎo)致血清成分如纖溶酶原、纖溶酶和其他酶的大量流入濃度會增加，其次是體細(xì)胞PMN大量聚集[21-22]。此外，乳腺上皮細(xì)胞還會產(chǎn)生表達(dá)的某些MMP和絲氨酸蛋白酶，參與纖溶酶原激活成纖溶酶[23]。血漿纖溶酶在多大程度上導(dǎo)致組織損傷存在爭議。中性粒細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-9、基質(zhì)溶解素-1、基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)增高，可能會導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生改變進(jìn)而影響細(xì)胞的通透性、電解質(zhì)降解導(dǎo)致組織損傷并且使細(xì)胞死亡[22]。

細(xì)胞因子是炎癥事件的中心介質(zhì)。細(xì)菌釋放強有力的毒素，刺激乳腺中的白細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[24]。在重組牛（Rb）IL-8作為潛在的治療劑治療奶牛隱性乳腺炎等方面的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺內(nèi)注射rbIL-8后，乳體細(xì)胞數(shù)和化學(xué)發(fā)光活性均顯著增加[25]。高水平的體細(xì)胞數(shù)和自由基誘導(dǎo)將導(dǎo)致組織損傷，而且乳腺感染后，中性粒細(xì)胞分泌細(xì)胞炎癥因子，諸如IL1B、IL6、CXCL8、TLR4和TNF基因的mRNA表達(dá)顯著上升。這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的多種功能，包括粘附、表面受體的表達(dá)、自由基的產(chǎn)生并釋放溶酶體成分在牛乳腺上皮細(xì)胞可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但隨著濃度升高，則反而通過調(diào)控和激活中性粒細(xì)胞對組織造成損傷[24]。

3? ? 防治措施

雖然乳腺炎組織損傷的機(jī)制尚未完全闡明，但藥物干預(yù)可能會阻斷乳腺炎組織中的蛋白水解或氧化級聯(lián)，從而減少乳腺炎過程中的組織損傷。迄今為止，該領(lǐng)域的研究主要集中在采用不同抗氧化劑如何減少乳腺組織中自由基。當(dāng)采用活化的牛中性粒細(xì)胞和免疫屏障-T細(xì)胞的共培養(yǎng)模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素谷胱甘肽乙酯可部分或全部消除活化的牛中性粒細(xì)胞對免疫屏障-T細(xì)胞的損傷作用，表明抗氧化劑能夠保護(hù)乳腺組織免受中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的牛乳腺氧化應(yīng)激[26]。鐵螯合劑去甲氧胺的輸注使牛奶中乳酸脫氫酶和乙酰氨基葡萄糖苷酶活性降低，表明對中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的損傷有保護(hù)作用[26]。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)，對10只奶牛經(jīng)乳內(nèi)接種乳酸菌，分別分析接種前及接種后1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、7 d、14 d的乳汁和血樣，發(fā)現(xiàn)與對照相比，增加了血液和牛奶中的IgG同種型數(shù)量并能夠識別金黃色葡萄球菌表位。由此表明，益生菌可以起到免疫調(diào)節(jié)的作用抵抗奶牛乳腺炎[27]。

4? ? 結(jié)語

目前，在理解奶牛乳腺炎的發(fā)病機(jī)制方面已取得很大進(jìn)步，但該病在世界各地的乳品工業(yè)中仍然是重大的經(jīng)濟(jì)問題。目前，相當(dāng)多的研究關(guān)注在中性粒細(xì)胞、細(xì)菌、宿主蛋白酶和細(xì)胞因子參與乳腺組織損傷，但對乳腺組織的損傷認(rèn)識仍不夠精確，有許多詳細(xì)機(jī)制尚不清楚[28]。因此，即使在最好的防控計劃下，乳腺炎仍然會發(fā)生，減少乳腺炎造成的經(jīng)濟(jì)損失是一項艱巨的任務(wù)。

5? ?參考文獻(xiàn)

[1] 白東東，李新圃，楊峰，等.世界奶牛乳腺炎研究發(fā)展態(tài)勢圖譜分析[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2019，40（4）：80-87.

[2] GURAO A，KASHYAP SK，SINGH R.β-defensins：an innate defense for bovine mastitis[J].Vet World，2017，10（8）：990-998.

[3] 蘇德勝.奶牛乳腺炎治療新策略研究進(jìn)展[J].獸醫(yī)臨床學(xué)，2017，49（1）：48-49.

[4] LI C，LI L，CHEN K，et al.UFL1 alleviates lipopolysaccharide-induced cell damage and inflammation via regulation of the TLR4/NF-κB pathw-ay in bovine mammary epithelial cells[J].Oxid Med Cell Longev，2019，10：6505373.

[5] 薛曉蓉，楊桂梅.奶牛乳腺炎發(fā)病機(jī)制及診療方法[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2017，47（2）：60-63.

[6] HOVINEN M，SIMOJOKI H，P？魻S？魻 R，et al.N-acetyl-β-D-glucosamin-idase activity in cow milk as an ndicator of mastitis[J].J Dairy Res，2016，83（2）：219-227.

[23] GREEN K A，LUND L R.ECM degrading proteases andtissue remodeling in themammary gland[J].Bioessays，2005，27：894-903.

[24] PAAPE M，BANNERMAN D，ZHAO X，et al.The bovineneutrophil：str-ucture and function in blood and milk[J].Vet Res，2003，34：597-627.

[25] TAKAHASHI H，KOMATSU T，HODATE K，et al.Effect of intramamm-ary injection of RbIL-8 on milk levelsof somatic cell count，chemilumi-nescence activity and sheddingpatterns of total bacteria and S. aureus in Holstein cows with naturally Infected-subclinical mastitis[J].J Vet Med，2005，52：32-37.

[26] LAUZON K，ZHAO X，LACASSE P.Deferoxamine reduces tissue dama-ge during endotoxin-induced mastitis in dairy cows[J].Journal of Dairy Science，2006，89（10）：3846-3857.

[27] PELLEGRINO M，BERARDO N，GIRAUDO J，et al.Bovine mastitis pr-evention：humoral and cellular response of dairy cows inoculated with lactic acid bacteria at the dry-off period[J].Benef Microbes，2017，8（4）：589-596.

[28] 李軍.奶牛乳腺炎的診斷及預(yù)防[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2019（13）：37.