HPLC-MS/MS法測定人體血液中阿米替林的濃度

陳澤冠

摘 要：目的：建立血液中阿米替林的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測方法。方法：以乙腈為沉淀劑，經(jīng)蛋白質(zhì)沉淀，取上清液進(jìn)高效液相串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（LC-MS/MS）分析。結(jié)論：阿米替林的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-0.00996052+2.83477*X（R^2=0.9998），定量下線為10ng/mL（S/N≥10：1），線性范圍為10～300ng/mL。阿米替林的精密度（RSD）在0.60～1.64%之間，準(zhǔn)確度為99.08～122.84%，在低、中、高質(zhì)量濃度下，阿米替林的平均提取回收率為97.99～98.22%。該方法操作簡單，靈敏度高，特異性強，可用于血液中阿米替林的定量測定。

關(guān)鍵詞：阿米替林;血液;高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號：R115 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2020）01-0247-02

阿米替林（amitripthyline）是臨床最常用的三環(huán)類抗抑郁藥，能選擇性地抑制中樞神經(jīng)突觸部位對去甲腎上腺素（NA）和5-羥色胺（5-HT）的再攝取，使突觸NA和5-HT的含量增加并促進(jìn)突觸后膜5-HT2受體的敏感性。阿米替林經(jīng)肝臟代謝，主要代謝產(chǎn)物為去甲替林，也有阿米替林的N-氧化物和10-羥衍生物以及去甲替林的10-羥衍生物，均有活性。

目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的有關(guān)阿米替林血濃度的測定方法較多，包括高效液相色譜法（HPLC）[1]、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用色譜法（GC-MS）[2]、高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS，LC-MS/MS）[3-5]。本文采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），采用蛋白沉淀方法測定血液中阿米替林濃度。

1 材料與試藥

1.1 儀器

臺式三重四極桿串接質(zhì)譜系統(tǒng)（含ESI電噴霧離子源）;U3000二元超高效LC;德國賽多利斯Quintix35-1CN。

1.2 試劑

鹽酸阿米替林，批號：100518-201303，純度：99.7%，中國食品藥品檢定研究院;SKF525A，批號：3-SNM-27-2，純度：99.83%，Toronto。

1.3 色譜條件

分析柱為Allure PFP Propyl 100mm×2.1mm×5μm，流動相為乙腈：20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液（70∶30），流速為200μL/min。柱溫為常溫。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（H-ESI）正離子選擇多反應(yīng)檢測（SRM）掃描分析，定量分析離子對分別為：m/z278.300→m/z233.268（阿米替林）;m/z354.300→m/z209.000（SKF525A）。

2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

在空白血液中分別加入阿米替林的工作液，配置成阿米替林濃度分別為10、20、50、100、200、300ng/mL的血液標(biāo)準(zhǔn)液。

3 血液樣品處理

精密量取100μL血液，加入內(nèi)標(biāo)50μL和沉淀劑乙腈900μL，混旋2min，10000轉(zhuǎn)/min離心2.5分鐘，取上清液1μL供LC-MS/MS分析。

4 方法考察

4.1 專屬性

分別取6份不同來源的不服用阿米替林的正常人空白血液100μL，不加內(nèi)標(biāo)，按“血液樣品處理”項處理，進(jìn)樣分析，得空白樣品色譜圖。另取空白血3份，1份加內(nèi)標(biāo)，1份加分析物，1份加內(nèi)標(biāo)和分析物，同法處理，得相應(yīng)色譜圖。

4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下線

含藥標(biāo)準(zhǔn)曲線血液按“血液樣品處理”處理后進(jìn)樣分析。以阿米替林添加濃度為X軸，樣品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為Y軸，進(jìn)行線性回歸，經(jīng)“Equal”權(quán)重得阿米替林標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

4.3 精密度、準(zhǔn)確度和提取回收率

取24份空白血液，分別配制定量下線及低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品各6份，按“血液樣品處理”項處理，進(jìn)樣分析，連續(xù)測定3批，計算精密度和準(zhǔn)確度。

分別配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各8份，其中6份于提取前加入工作液和內(nèi)標(biāo)，另2份于提取后加入工作液和內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣分析，計算提取回收率。

4.4 穩(wěn)定性

制備低、高質(zhì)量濃度的血液質(zhì)控樣品，分別考察在常溫光照放置放置24h、反復(fù)凍融3次、-70℃凍存1個月、進(jìn)樣器內(nèi)24h條件下的穩(wěn)定性。

4.5 基質(zhì)效應(yīng)

分別取6種不同來源的空白血清90μL，按“血液樣品處理”處理，得空白基質(zhì)后，分別加入低、高質(zhì)量濃度工作液10μL及內(nèi)標(biāo)50μL，制備成基質(zhì)考察樣品，進(jìn)樣分析，得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值A(chǔ)1。用去離子水代替血液，同法操作，得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值A(chǔ)2。內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子=A1/A2×100%。

5 結(jié)果

5.1 專屬性

阿米替林的保留時間約為4.54min，SKF525A的保留時間約為5.70min，血液中內(nèi)源性物質(zhì)對目標(biāo)分析物及其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的測定無干擾，專屬性好，見圖1。

5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

阿米替林的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-0.00996052+2.83477* X（R^2=0.9998），定量下線為10ng/mL（S/N≥10∶1），線性范圍為10～300ng/mL。

5.3 精密度、準(zhǔn)確度和提取回收率

阿米替林的精密度（RSD）在 0.60～1.64%之間，準(zhǔn)確度為99.08～122.84%，在低、中、高質(zhì)量濃度下，阿米替林的平均提取回收率為97.99～98.22%，結(jié)果見表1。

5.4 穩(wěn)定性

含藥血液質(zhì)控樣品在常溫光照下放置24h、反復(fù)凍融3次、-70℃凍存1個月、進(jìn)樣器內(nèi)24h各條件下穩(wěn)定，RSD小于15%。

5.5 基質(zhì)效應(yīng)

阿米替林在低和高2個質(zhì)量濃度水平下的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子RSD分別為1.87%、0.85%，小于15%，樣品測定不受基質(zhì)效應(yīng)影響。

6 討論

本實驗采用LC-MS/MS建立的檢測人血液中阿米替林的方法，所需血液樣品量少，專屬性好，靈敏度高，準(zhǔn)確穩(wěn)定。以乙腈為沉淀劑，采用蛋白沉淀法處理樣品，簡單快捷，可快速對樣品進(jìn)行定性定量分析。

參考文獻(xiàn)

[1] 李金恒，許勁秋，曹曉梅，等.反相高效液相色譜法測定血漿中阿米替林及其代謝物去甲替林的總濃度和游離濃度[J].中國藥理學(xué)通報，2001，17（1）：104.

[2] Paterson S，Cordero R，Burlinson S.Screening and semi-quantitative analysis of post mortem blood for basic drugs using gas chromatography/ion trap mass spectrometry[J].J Chromatogr B，2004，813（1）：325.

[3] Castro A，Concheiro，M，Quintela O.LC-MS/MS method for the determination of nine antidepressants and some of their main metabolites in oral fluid and plasma-Study of correlation between venlafaxine concentrations in both matrices[J].J Pharm Biomed，2008，48（1）：184.

[4] Shinozuka T，Terada M，Tanaka E.Solid-phase extraction and analysis of 20 antidepressant drugs in human plasma by LC/MS with SSI method[J].Forensic Sci Int，2006，162（1）：108.

[5] 王賢親，吳健章，李艷霞，等.LC-MS/MS測定人血漿中阿米替林的含量[J].藥物分析雜志，2009，29（11）：1846-1849.