添加液去白洗滌紅細(xì)胞在保存中的質(zhì)量觀察

鄭井濱 張麗 姚美辰 李靜旗 王雅卿 畢聰璽

洗滌紅細(xì)胞是輸血治療中一種常用的血液制劑，是采用特定的方法將保存期內(nèi)的全血、懸浮紅細(xì)胞用大量等滲溶液洗滌，去除幾乎所有血漿成分和部分非紅細(xì)胞成分，并將紅細(xì)胞懸浮在生理鹽水或紅細(xì)胞添加液中所制成的紅細(xì)胞成分血[1]。常規(guī)洗滌紅細(xì)胞的制備方法是用生理鹽水作為洗滌液和懸浮液來制備，保存期只有24小時。因此，臨床使用洗滌紅細(xì)胞時需采用預(yù)約的方式，現(xiàn)制現(xiàn)用，臨床輸血的及時性較難保證[2]。預(yù)約、制備、運輸?shù)臅r間耽擱可能會造成部分患者尤其是急診患者不能及時輸血而影響疾病的治療。雖然目前部分采供血機構(gòu)向臨床提供了可保存的添加液洗滌紅細(xì)胞，但保存期限相差懸殊[3-7]，為了解可保存的去白洗滌紅細(xì)胞在保存期內(nèi)的質(zhì)量情況，我們進行了系統(tǒng)觀察，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

1 添加液去白洗滌紅細(xì)胞的制備 隨機選取8袋全血（紅細(xì)胞保養(yǎng)液為ACD），采集時間6 h內(nèi)過濾法制備去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞，懸浮液為MAP（甘露醇-腺嘌呤-磷酸鹽），然后將每袋去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞平均分為6份，1份直接置于2～6 ℃冰箱中保存（對照組），用于血液長期保存過程各項指標(biāo)的對比觀察，其余5份用生理鹽水或MAP進行洗滌，再分別用生理鹽水、MAP及ACD（枸櫞酸-枸櫞酸鈉-葡萄糖）中的一種進行懸浮。根據(jù)洗滌液和懸浮液的不同分組如下：生理鹽水洗滌-生理鹽水懸浮組（N-N組）、生理鹽水洗滌-MAP懸浮組（N-M組）、生理鹽水洗滌-ACD懸浮組（N-A組）、MAP洗滌-MAP懸浮組（M-M組）、MAP洗滌-ACD懸浮（M-A組）。制備方法同常規(guī)洗滌紅細(xì)胞[8]，制備后置于2～6 ℃冰箱中保存。

2 儀器與試劑 電解質(zhì)分析儀（日本富士 FDC-800）、多參數(shù)測試儀（Mettler Toledo SG78）、全自動生化分析儀（羅氏 C111）、血細(xì)胞計數(shù)儀（日本Sysmex XT-1800i）、大容量血細(xì)胞計數(shù)盤（Nageotte）、離心機（貝克曼 J-6B）、無菌接口機（泰爾茂 TSCD-II）、冰箱（日本三洋 SR1410）。腦脊液與尿蛋白測定試劑盒（北京利德曼），血漿游離血紅蛋白測定試劑盒（北京瑞爾達(dá)）、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基及胰酪大豆胨培養(yǎng)基（南京樂診）。生理鹽水、MAP、ACD均來自上海輸血技術(shù)有限公司。

3 檢測方法 各組去白細(xì)胞洗滌紅細(xì)胞制備完成后立即取樣進行如下項目檢測：K+濃度、pH、游離血紅蛋白、血紅蛋白含量、上清蛋白含量、白細(xì)胞殘留量、無菌實驗。之后按照保存的時間間隔1天、3天、7天、14天、21天、28天、35天分別取樣進行K+濃度、pH、游離血紅蛋白項目檢測。測量方法：K+濃度采用離子選擇電極法測量（K+濃度低于1 mmol/L時顯示over range,為了便于統(tǒng)計分析，取1 mmol/L進行計算），pH采用多參數(shù)測試儀電極法進行測量，其它項目按照試劑盒說明書進行檢測。血紅蛋白含量、上清蛋白含量、白細(xì)胞殘留量測得的結(jié)果均乘以3轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)1U去白細(xì)胞洗滌紅細(xì)胞中的結(jié)果。

4 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示，洗滌后即刻檢測的項目（血紅蛋白、上清蛋白、白細(xì)胞殘留量），各洗滌實驗組采用單因素方差分析。其它項目根據(jù)不同的分組與各時間間隔按照重復(fù)測量的析因設(shè)計進行方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，兩組間比較采用統(tǒng)計軟件包中的LSD檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 去白洗滌紅細(xì)胞制備后即刻檢測的血紅蛋白含量、上清蛋白含量、白細(xì)胞殘留量和無菌試驗項目結(jié)果見表1。

表1 去白洗滌紅細(xì)胞即刻檢測項目檢測結(jié)果

2 K+濃度檢測結(jié)果 在保存過程中，去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞（對照組）及各洗滌實驗組上清液中K+濃度、pH值及FHb含量變化情況見表2。各“時間”點對應(yīng)的F=2 733.303，P＜0.05，說明不同時間點之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義；“時間*分組”所對應(yīng)的F=28.678，P＜0.05，時間與分組的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義；“分組”對應(yīng)的F=438.233，P＜0.05，不同分組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。LSD分析結(jié)果：對照組、N-M組與M-M組，三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；其余各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。洗滌后0天，N-M組和M-M組K+濃度為1.3 mmol/L，之后逐漸升高，在第3天時達(dá)到去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞（對照組）水平。N-N組在第7天后K+濃度顯著升高，但低于N-A組與M-A組。（見圖1）

3 pH值檢測結(jié)果 在儲存期間，pH變化結(jié)果見表2，趨勢走向情況見圖2。各“時間點”對應(yīng)的F=2.829，P＜0.05；“分組”對應(yīng)的F=60.376，P＜0.05；“時間*分組”所對應(yīng)的F=3.869，P＜0.05。不同時間點、分組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，時間與分組存在交互作用。LSD分析結(jié)果：對照組與N-N組；N-M組與M-M組；N-A組與M-A組小組內(nèi)兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而與其它組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

4 FHb含量檢測結(jié)果 在保存過程中，上清中FHb情況見表1。各“時間點”對應(yīng)的F=569.242，P＜0.05，說明不同時間點之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義；“時間*分組”所對應(yīng)的F=47.016，P＜0.05，時間與分組的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義；“分組”對應(yīng)的F=74.899，P＜0.05，不同分組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。LSD分析結(jié)果：對照組、N-M組與M-M組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；N-N組與N-A組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），M-A組與其他各組均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。5 綜合K+、pH和FHb三項實驗結(jié)果，在5個實驗組中，M-M組及N-M組保存效果較為理想，以N-M組最佳。

表2 保存過程中K+濃度、pH值及FHb含量變化（n=8）

圖1 保存過程中K+濃度變化情況

討 論

圖2 保存過程中pH值變化情況

輸血作為一種重要的治療手段，被臨床廣泛應(yīng)用，但輸血同時也會使受血者產(chǎn)生各種輸血不良反應(yīng)。不同的血液成分制品可引起的輸血不良反應(yīng)種類、程度及發(fā)生概率也會有所不同。洗滌紅細(xì)胞制品因在制備過程中去除了大部分白細(xì)胞、細(xì)胞碎片、血漿蛋白等成分，可以有效減少輸血發(fā)熱、過敏等不良反應(yīng)。目前臨床上洗滌紅細(xì)胞制品主要用于輸入全血或者血漿后發(fā)生過敏反應(yīng)（蕁麻疹、血管性神經(jīng)性水腫、過敏性休克等）的患者、高血鉀癥及肝、腎功能障礙需要換血的患者等[9]。常規(guī)洗滌紅細(xì)胞的保存期只有24小時，預(yù)約洗滌機制不利于患者的及時救治，可長期儲存的洗滌紅細(xì)胞應(yīng)用前景廣泛。通過本次實驗結(jié)果可以看出，無論采用何種洗滌液（生理鹽水、MAP）何種懸浮液（生理鹽水、MAP、ACD）制備的去白洗滌紅細(xì)胞，即刻檢測出的血紅蛋白含量、上清蛋白含量、白細(xì)胞殘留量和無菌試驗結(jié)果均滿足國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨著儲存時間的延長，各種血液成分中K+濃度都有增高的趨勢，未洗滌對照組及經(jīng)過洗滌制備的N-N組、N-M組、M-M組在保存3天時有部分樣本濃度超過了正常人參考區(qū)間[10]，而N-A組和M-A組則在保存第1天就已經(jīng)超過此范圍。本次實驗結(jié)果趨勢與文獻(xiàn)基本一致，檢測值略有不同[3,5,11-13]，這可能與加工制備的血液原料類別、制備的時間、加工方式等有一定關(guān)系。MAP組成成分中由于腺嘌呤的加入，可提高血液ATP在4℃貯存期間的活性水平，延長血液的保存時間，但對于其成分過敏者及新生兒溶血病的換血治療時禁止使用該添加液。也有文獻(xiàn)表明應(yīng)用300mg/（kg·d）大劑量（遠(yuǎn)高于保養(yǎng)液中的含量）腺嘌呤對動物灌胃三周左右，可用來制備動物腎衰竭模型，出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化，腎功能異常[14]。ACD與MAP比較，血液保存期只有21天，其成分中不含甘露醇、腺嘌呤、氯化鈉和磷酸二氫鈉，組成成分更單一，輸入患者體內(nèi)后負(fù)擔(dān)可能更小，為此本文嘗試?yán)肁CD對洗滌紅細(xì)胞進行保存。但從本次實驗結(jié)果可以看出，當(dāng)用ACD來替代MAP對洗滌紅細(xì)胞進行保存時，沒有取得理想的預(yù)期效果，甚至劣于生理鹽水的保存效果。無論用生理鹽水進行洗滌還是MAP進行洗滌，當(dāng)用ACD進行懸浮保存時，由于ACD的pH（4.5～5.5）比MAP（5.0～6.0）更偏酸性，會使紅細(xì)胞一直處于pH較低的酸性環(huán)境，此時對于細(xì)胞損傷比較嚴(yán)重，會加速其溶血，溶血程度甚至高于N-N組。通過圖2也可以看出，利用ACD進行保存時，其產(chǎn)品pH在儲存期間一直在上升，與其它實驗組對照組的下降趨勢剛好相反，通過本次實驗可以看出對于MAP保存的去白懸浮紅細(xì)胞不適宜以ACD作為添加液來制備可保存的洗滌紅細(xì)胞，但能否通過改變起始血液成分，從ACD抗凝的全血直接制備洗滌紅細(xì)胞，有待于后續(xù)進一步研究。

綜合K+、pH和FHb三項實驗結(jié)果，在5個實驗組中，M-M組及N-M組保存效果較為理想，以N-M組最佳。雖然大量輸注保存期3周以上的血液有引起患者高血鉀的風(fēng)險，但輸血速度不超過（100～150）mL/min，很少會發(fā)生嚴(yán)重的高血鉀[15]。當(dāng)輸血量不多時，成分血中的K+迅速被患者體內(nèi)的血液及細(xì)胞外液所稀釋，一般不會有明顯的血鉀變化[9]。大量輸血時，如果短時間內(nèi)輸入大量保存期較長的成分血，則可能出現(xiàn)高血鉀或者低血鉀，這與患者自身的基礎(chǔ)代謝情況有關(guān)。如果患者腎功能正常，當(dāng)血鉀增高時，機體內(nèi)醛固酮、抗利尿激素和糖皮質(zhì)激素分泌增加，促進腎臟排鉀；Na+-K+-ATP泵對溫度變化高度敏感，4℃時幾乎喪失功能，輸入患者體內(nèi)的血液隨著pH及溫度環(huán)境的改善，Na+-K+-ATP泵功能逐漸恢復(fù)，也可以促進血K+向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，使鉀離子趨向正常范圍。另外，血液保養(yǎng)液中含有枸櫞酸鹽成分，枸櫞酸鹽在肝臟可迅速轉(zhuǎn)化為碳酸氫鈉，出現(xiàn)代謝性堿中毒，細(xì)胞內(nèi)的氫離子與細(xì)胞外的鉀離子，氫鉀交換來緩沖堿中毒，出現(xiàn)低血鉀；當(dāng)機體出現(xiàn)堿中毒時，腎臟排鉀增加，也會使血鉀下降。目前國家標(biāo)準(zhǔn)中尚沒有對于洗滌紅細(xì)胞（儲存期24 h）和可長期保存的洗滌紅細(xì)胞（保存期同懸浮紅細(xì)胞）中K+濃度的質(zhì)量控制要求，若以K+濃度不超過5.5 mmol/L作為限值，通過本次實驗結(jié)果分析及相關(guān)資料了解，我們認(rèn)為對于無高鉀血癥、肝腎功能正常的患者可以輸注在有效期內(nèi)的添加液去白洗滌紅細(xì)胞，但對于一些特殊患者，如自身有高K+血癥傾向患者建議使用儲存期為24 h的生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，或保存期在3天內(nèi)的MAP添加液去白洗滌紅細(xì)胞。

綜上，洗滌紅細(xì)胞（儲存期24 h）和可長期保存的洗滌紅細(xì)胞（保存期同懸浮紅細(xì)胞）并非是完全相同的兩種血液產(chǎn)品，而是應(yīng)該根據(jù)患者的臨床病情，針對性選擇，對于肝臟、腎臟無功能障礙，腎臟循環(huán)血量正常的貧血患者，可任意選擇其一，但是對于患者自身存在高鉀血癥、腎功能代謝障礙（如尿毒癥或有大量嚴(yán)重創(chuàng)傷合并腎功能不全）代謝性酸中毒等特殊患者，為了安全起見，建議輸用3天內(nèi)的MAP添加液去白洗滌紅細(xì)胞或傳統(tǒng)生理鹽水懸浮的洗滌紅細(xì)胞（儲存期24 h）。